鹅细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

董 浩，徐楠楠

(1.吉林农业大学生命科学学院，长春 130118;2.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118;3.长春市农业学校，长春 130102)

小鹅瘟是由鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)引起的雏鹅的一种急性、高度接触性、败血性传染病，传染性强、病程短且死亡率高。它多发生于出壳后20日龄左右的雏鹅，其中3～5日龄雏鹅为多发日龄，发病雏鹅经数天就波及全群，死亡率可高达70%～95%。由于该病病程短促且有较强的传染、传播、致死亡能力，目前已成为影响养鹅业健康发展的危害最为严重的传染病，同时也给养殖户和社会造成了巨大的经济损失。感染的病鹅或番鸭可通过排出带有大量病毒的粪便，直接或间接接触将小鹅瘟病毒传播给健康鹅群，从而导致本病迅速传播。该病毒也可通过垂直传播，成年鹅尤其是产蛋种鹅在传播中成为隐性感染者、病毒携带者，它可通过鹅蛋将病毒传播给易感的雏鹅，所以产蛋种鹅是重要的传染源，也是新生雏鹅爆发小鹅瘟的重要原因。开展GPV在产蛋种鹅体内定植规律研究，可为从源头上防控小鹅瘟提供科学依据，是深入开展小鹅瘟感染、致病和复制机制研究的基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 小鹅瘟病毒 SP株［1］、鹅副黏病毒、鹅禽流感、鹅的鸭瘟病毒均由吉林农业大学动物科技学院实验室保存。

1.1.2 试验动物 产蛋种鹅为产前15日龄吉林白鹅，购于长春某鹅厂。

1.1.3 主要试剂与载体 DNA提取试剂盒、DL2000 DNA Marker、dNTPs、ExTaq DNA 聚合酶、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等均购自TaKaRa(大连公司)。T-GPV-VP3质粒由吉林农业大学动物科技学院实验室在pMD-18T载体基础上构建的带有VP3的阳性质粒。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针的设计 根据GPV SP株VP3基因序列(GenBank登陆号:FJ158588)，选择VP3保守基因序列，设计一对荧光定量PCR引物和Taq Man探针。引物由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司合成，序列如表1所示。

表1 名称、序列及扩增片段长度

1.2.2 荧光定量PCR检测GPV VP3基因的标准曲线的建立 取2 μL T-GPV-VP3质粒，加入18 μL双蒸馏水稀释为原浓度的1×10-1，依次10倍梯度稀释为1 ×10-2、1 ×10-3、1 ×10-4、1 ×10-5浓度的重组质粒DNA。每个稀释度设3组重复，设置一个对照组，以双蒸馏水为模板，进行Taq Man荧光定量检测。PCR反应各组分如下:Premix Ex TagTM(2 ×)12.5μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，荧光探针溶液 1 μL，模板 2 μL，补双蒸水至25 μL。具体反应条件为:95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 40 s，共40个循环。检测完毕后，启用随机软件，分别录入相应阳性质粒拷贝数，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果，绘制标准曲线。

1.2.3 荧光定量PCR检测VP3特异性试验 以种鹅常见病毒性疾病鹅副黏病毒、鹅禽流感、鹅的鸭瘟病毒为模板，应用上述已建立的荧光定量PCR方法，检测此方法的特异性。

1.2.4 荧光定量PCR检测VP3灵敏性试验 将已知拷贝数的标准质粒做10倍梯度稀释至3.5×102个拷贝/μL，以各梯度稀释液为模板进行PCR反应。最低起始模板浓度即为此PCR反应的灵敏度。

1.2.5 人工感染种鹅试验 将购买的产前15日种鹅30只(经琼脂扩散试验检测为GPV阴性)随机分为2组，试验组20只，对照组10只。试验组皮下注射接种GPV SP株鸭胚尿囊液，对照组接种生理盐水，每只接种0.5 mL。从病毒感染试验后开始，分别在第1、3、7、15、30 天进行采样，每个时间段捕杀4只试验组种鹅、2只对照组种鹅，采取十二指肠、空肠、盲肠、心脏、肝脏、肾脏、卵巢、输卵管等组织脏器，十二指肠、空肠、盲肠、输卵管取1 cm长，心脏、肝脏、肾脏、卵巢取500 mg，研磨处理病料，加入PBS缓冲液，制成匀浆，反复冻融三次，分离上清液。

1.2.6 种鹅GPV定植规律研究 提取1.2.5项上清液中病毒DNA，按照1.2.2项的体系和条件进行荧光定量PCR，绘出荧光扩增曲线图，根据结果分析得出各个样品的Ct值，按照标准曲线计算出样品的起始拷贝数和样品的病毒浓度。从而得到GPV在产蛋种鹅体内的定植规律。

2 结果

2.1 荧光定量PCR检测VP3标准曲线建立结果采用Taq Man实时荧光定量PCR方法，检测标准品的连续5个不同稀释度扩增时的荧光信号，反应结束后系统自动生成模板浓度扩增反应的动力学曲线(图1)。以Ct值为纵坐标，不同标准品梯度稀释的拷贝数的对数为横坐标，获得标准曲线(图2)，标准曲线的相关系数均大于0.99(R2＞0.99)，可见real-time PCR在稀释度范围内呈现良好的线性关系。从而根据未知样品的相对应基因的Ct值，即可得出起始模板的精确拷贝数，进而对样品进行定量分析。

图1 T-GPV-VP3的扩增曲线(各曲线按Ct值

图2 GPV-VP3的标准曲线

2.2 荧光定量PCR检测GPV特异性试验结果根据PCR的扩增特性和阴性对照的荧光信号强度确定Ct值。Ct值小于30，确定为阳性样品;Ct值大于35，为阴性样品;Ct值在30～35之间判为可疑，应重复试验，重复后大于30，即判为阴性。特异性荧光PCR扩增曲线结果如图3所示，重组质粒Ct值小于29为阳性，而鹅副黏病毒、禽流感病毒、鹅的鸭瘟病毒为模板DNA的Ct值均大于35为阴性，表明该检测体系对GPV为特异性扩增。

图3 T-GPV-VP3的特异性扩增曲线

2.3 荧光定量PCR检测GPV灵敏性试验结果当模板浓度为3.5×103个拷贝/μL时，荧光定量PCR可以扩增出特异性产物，因此，该PCR方法检测灵敏度为3.5 ×103个拷贝/μL。

2.4 重复性试验结果 对于不同浓度的模板，4个平行样品之间的Ct值差异不显著，表明该方法具有很好的重复性。

图4 部分样品的扩增曲线

2.5 人工感染种鹅荧光定量PCR检测结果 对试验组种鹅各个脏器DNA进行荧光定量PCR扩增，扩增曲线如图4所示。根据扩增曲线中样品的Ct值，按照标准曲线的公式计算出样品的起始病毒含量(表2)。

表2 不同感染时间各部位病毒含量/2 μL组织 DNA(Lg，n=3)

3 讨论

目前国内外开展了GPV在雏鹅和雏番鸭分布规律研究，但未见开展病毒在种鹅体内定植研究。有相关报道称，小鹅瘟病毒可垂直传播［2-3］，小鹅瘟病毒只感染雏鹅，死亡率很高;种鹅是成年鹅，不表现临床症状，但可携带病毒，并能排毒撒毒，污染周围环境。检测病毒的方法很多，包括免疫学检测和分子生物学检测，免疫学的方法有一定的误差，更精确的检测需要进入分子生物学的研究，荧光定量PCR是分子生物学研究中常用和可靠的方法［4-6］。荧光定量PCR的方法很多，本实验选择Taq Man探针荧光定量PCR，Taq Man探针是一种核苷酸探针，探针长度在15～45 bp(最好是20～30 bp)，在探针的 5’端带有荧光物质——FAM，3’端带有荧光淬灭物质——Eclipse。当探针与靶序列相交时，FAM和Eclipse接近，荧光基团被淬灭，没有荧光信号，PCR反应到延伸阶段时，聚合酶的外切酶活性将探针切开，FAM和Eclipse分开，FAM重新发出荧光信号，此信号被收集。Taq Man探针法所使用的引物和探针是针对一种核酸设计的，具有高度的特异性，并避免了普通PCR出现假阳性的可能。Taq Man探针法结果直观、清晰，减少了普通PCR产物电泳观察所带来的危害和麻烦，同时具有稳定性、可靠性和重复性。

通过检测结果可以看出，人工感染成年种鹅24 h后，能够在肠段、粪、心、肝、脾脏、肾脏、输卵管和卵巢中检测到病毒DNA，虽然没有表现出任何临床症状，GPV可以通过皮下接种的方式进入机体，并在上述器官中增殖;在病毒感染72～168 h出现病毒感染的高峰期，并且在肝脏、脾脏、粪便、肠道和输卵管中病毒含量持续较高水平，肠道中的含量最高;随后，病毒的增殖明显减少，病毒感染360 h后，减少最快的是在心脏和肾脏中，已经检测不到病毒的存在;在病毒感染720 h后，在肠道、输卵管和卵巢中检测不到GPV病毒DNA;在病毒感染15 d后，可在输卵管和卵巢中检测到微量的GPV，本实验的实验鹅为开产前15日的成年种鹅，在产蛋时，可能随着卵巢和输卵管将GPV带到鹅蛋中，使小鹅瘟传播。本研究为临床更好地诊断和监测小鹅瘟病毒提供了精密准确的手段，为合理使用小鹅瘟疫苗提供了一定的理论依据。

［1］董 浩，马 磊，单晓枫，等.霍尔多巴吉白鹅小鹅瘟病毒的分离与鉴定［J］.中国兽医杂志，2010，46(10):49-50.

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［3］毕建敏.鹅细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用及其VP3基因序列分析［D］.山东农业大学，2007，6(15):98-101.

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［5］Bustin S A，Mueller R.Real-time Reverse Transcription PCR(RT-PCR)and Its Potential Use in Clinical Diagnosis［J］.Clinical Science，2005，10(9):365-379.

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