骨腱结合部损伤模型建立及伤后低强度循环载荷对愈合的影响

王 琳，高维纬，熊开宇，刘 宁，王 博，梁 戈，徐 斌，温春毅，吕维加

(1.北京体育大学，北京 100084;2.香港大学创伤与矫形外科学系)

骨腱结合部损伤模型建立及伤后低强度循环载荷对愈合的影响

王 琳1，高维纬1，熊开宇1，刘 宁1，王 博1，梁 戈1，徐 斌1，温春毅2，吕维加2

(1.北京体育大学，北京 100084;2.香港大学创伤与矫形外科学系)

骨腱结合部过度使用性损伤常见于运动员。研究伤后48h进行低强度载荷训练对急性骨腱结合部损伤愈合的影响。研究对象和方法:12只雌性成年新西兰大白兔的后肢通过针刺建立急性损伤组(AI，n=6)，伤后48h开始进行四周低强度训练建立伤后低强度训练组(PIERT，n=6)和对照组(CON，n=6)。第四周取样的标本结果提示，PIERT组的骨小梁厚度明显小于AI和CON组;和CON组相比，AI和PIERT组的胶原排列明显紊乱，瘢痕组织多，细胞密度低;PIERT组的纤维软骨带厚度明显厚于AI组。建立了一个定量、可重复骨腱结合部微细损伤动物模型，并发现伤后48h开始低强度训练没有延缓损伤愈合，并对结构重建具有一定促进作用。

骨腱结合部;髌骨;早期伤后训练;定量载荷;损伤愈合

骨腱结合部(BTJ)慢性损伤是常见的运动损伤和职业损伤［1-2］，这对运动训练会带来明显影响［3-4］。实际训练中，BTJ损伤主要由于微细损伤的积累或者反复发生的超负荷训练所致［4-6］。Thomopoulos和我们前期建立的损伤愈合延迟动物模型结果都提示，肌肉载荷对肌腱—骨结合部损伤愈合质量与受力有明显关系，缺乏应力刺激组的损伤愈合质量明显下降［7-8］。有多种原因导致运动员的BTJ慢性损伤发生率明显高于普通人［9-10］。慢性超负荷使用是主要原因之一，它导致微细损伤或者重复损伤发生［11］;另外，BTJ的纤维软骨带组织自身再生修复能力差也是一个原因;另外一个可能因素是运动员急性损伤后恢复训练过早。运动员都渴望尽快恢复训练以减少损伤所带来的对训练的影响，只要损伤不严重，他们常常在伤后2～3天开始恢复训练。本研究的主要目的是建立骨腱结合部微细损伤动物模型，并探讨在伤后48h开始进行低强度训练对损伤愈合的影响。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

12只雌性新西兰大白兔(18周龄，体重2.5±0.3kg)被分为急性损伤组(AI，n=6)，伤后早期恢复训练组(PIERT，n =6)和空白对照组(CON，n=6)。兔子的左后肢被用于造成急性损伤和伤后训练，右后肢被用做AI组和CON组。采用0.25%戊巴比妥钠(2ml/kg)(Sigma Chemicals Co，St Louis，Mo，USA)腹腔注射麻醉，AI组髌腱止点处采用双头梅花针的7针束状端在髌腱于髌骨下2/3表面(髌腱止点)进行针刺损伤(图1)。PIERT组在进行相同损伤后48h进行低强度训练。在伤后训练中，兔子被仰卧位固定，膝关节和髋关节屈曲90°。两根针灸分别垂直刺入股四头肌1/3和2/3位置。左后肢进行2h电刺激(PIERT组)，右后肢不进行电刺激(AI组、CON组)，PIERT组每周训练3次，每次采用训练强度为使股四头肌产生约2.1牛顿收缩力(相当最大收缩力的30%)［12］。采用1Hz脉冲，刺激频率100次/秒，每次训练收缩7 200次。兔子在笼内自由活动，标准食物喂养，自由进食和饮水。

在训练四周后，25%戊巴比妥钠过量麻醉处死，髌骨—髌腱复合体被采集，-20°冰箱保存。进行MicroCT扫描后，10%福尔马林固定24h，70%酒精保存以待进行组织学研究。

1.2 研究方法

1.2.1 骨微细结构分析 骨微细结构采用MicroCT系统进行扫描和三维重建及分析(SkyScan1076μCT scanner，Sky-Scan，Kontich，Belgium)。标本被平行放入扫描管中，扫描管与扫描球管垂直，所采用的分辨率为9μm，采用连续扫描方式，扫描角度0～180°。分析感兴趣区选择在髌尖开始向上480片，三维图像通过Skyscan扫描系统内建的NRecon(version:1.6.3.3)软件重建，评价指标包括:组织体积(TV)、骨体积(BV)、骨量比(OBV)、骨体积比值(BV/TV)、骨小梁数量(Tr.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)，上述指标通过 SkyScan CTAn分析软件进行计算以用于组间比较。

1.2.2 组织学指标 扫描后的标本随后采用4%甲酸脱钙，沿矢状面正中一分为二后进行石蜡包埋，切片厚度5μm。进行苏木伊红(H＆E)和Safranin O染色，用于组织形态学观察、粘多糖蛋白分布面积、细胞密度和纤维软骨带厚度(FZT)测量(Nikon Eclipse 50i，Nikon Inc.，Japan)。

1.2.3 细胞密度和纤维软骨带厚度定量分析 肌腱细胞密度和纤维软骨带厚度采用我们过去所建立的测定方法进行测量［8，13］。简单来说，肌腱细胞密度的计算是通过图像分析软件(Image-Pro Plus version 5.1)在100倍H＆E染色切片上沿纤维软骨带随机选取5个正方形感兴趣区(AOI)(100 ×100μm)进行细胞核计数。纤维软骨带厚度则是在髌骨矢状面下，通过使用图像分析软件测量纤维软骨带面积和长度，用纤维软骨带面积/长度而获得厚度。

1.3 数理统计法

所有数据以平均数±标准差表示，组间数据比较采用Oneway-Anova对TV、OBV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N、粘多糖蛋白分布面积、肌腱细胞密度和纤维软骨带厚度进行处理。显著性差异水平采用P＜0.05。

2 结果2.1 MicroCT扫描结果

MicroCT扫描结果显示，AI组的Tb.Th(0.67±0.25)mm明显厚于PIERT组(0.44±0.15)mm(P＜0.01);在CON组(0.52±0.10)mm与AI、PIERT组之间未见到显著性差异(P＞0.05)。TV、OBV、BV/TV和Tb.N在三组之间差异未达到显著性水平(见表1)。与CON组相比，Tb.N在PIERT组呈现增多趋势，而AI组呈现减少趋势，只是由于该指标的标准差大而没有在统计学上表现出显著性差异。

表1 骨结构指标的组间比较

2.2 组织学结果

组织学结果(图2)显示，实验组的AI和PIERT组的骨腱结合部分别可以见到其潮线变得不清晰、甚至消失，局部出现细胞明显减少区域，有类似于瘢痕组织结构形成(图2A);还可以见到局部软骨细胞明显增大、增多，并且排列无序(图2B);而CON组表现出清晰的形态规则的潮线，骨腱结合部细胞排列规则，肌腱、未钙化纤维软骨带、钙化纤维软骨带和骨之间各层结构清楚(图2D);胶原排列整齐，粗细均匀(图2F)。AI组(图2D)和PIERT组(图2E)的胶原排列有序性明显差于CON组。

2.3 肌腱细胞密度和纤维软骨带厚度结果

肌腱细胞密度在CON组(31.84±9.64)个/100μm2明显高于PIERT(16.78±7.52)个/100μm2(P＜0.01)和AI组(14.3±6.19)个/100μm2(P＜0.01)，但是在PIERT组和AI组之间未见到显著性差异(P＞0.05)。PIERT组的纤维软骨带厚度(213.52±57.42)μm明显厚于 AI组(140.68± 543.09)μm(P＜0.01)和CON组(160.22±52.85)μm(P＜0.01)(表2)。结果提示AI组和PIERT组结构改变在伤后第四周依然存在。

表2 肌腱细胞密度和纤维软骨带厚度结果

图2 第四周时髌骨矢状面切片，H＆E染色

3 讨论

腱病(Tendinopathy)是一种不易愈合的慢性损伤，在运动员其发生的主要原因之一是长期训练负荷刺激［12-14］，一直以来都认为伤后开始训练过早会加重损伤，但是却很少见到这方面的系统研究报道［15-16］。本研究通过定量方式施加负载，从骨微细结构、组织形态学的角度描述骨腱结合部微细损伤动物模型建立和伤后48h开始训练对骨腱结合部急性损伤愈合的影响。从总体来看，本研究所采用的损伤造模方法在第四周时造成了损伤不愈合的模型，在急性损伤后48h开始低强度训练并没有明显延缓损伤愈合过程。

在microCT的骨结构改变指标中，只有 PIERT组的Tb.Th与AI组之间差异达到显著性差异水平，但是CON组与AI组和PIERT组之间差异均未达到显著性差异水平。而且与 CON组相比，PIERT组是其 84.61%，AI组是其128.85%，说明PIERT组与AI组呈现出两个相反方向变化，这种变化显然与PIERT组的训练载荷有关。来自股四头肌的力量作用在髌腱止点会导致局部结构改变，Tb.Th是用于描述骨骼微细结构重建的重要指标，其厚度与受力之间存在因果关系［17］。本研究结果提示牵拉性应力，使髌骨骨小梁厚度减少，而损伤后休息呈现出相反变化趋势;虽然Tb.N在各组件未出现统计学差异，在平均值上PIERT的Tb.N分别是AI组的4.2倍、CON组的2.5倍。这种变化可以被认为是应力刺激导致了伤后早期运动对髌骨微细结构上产生明显影响，但是这改变是向着恢复正常结果进行，因为AI和PIERT组与CON组相比所有指标都没有见到显著性差异性改变［18-19］。

骨腱结合部慢性损伤常常表现出胶原纤维排列紊乱、细胞退行性变、血管增生、细胞数量增多或者减少以及纤维软骨带改变［12，20，21］。在AI和PIERT组，组织学结果显示其胶原纤维排列有序性明显差于CON组(图2);在骨腱结合部可见到AI和PIERT组局部的“潮线”变得模糊，甚至消失、局部瘢痕形成、软骨细胞聚集(图2A、B);在偏振光下可以看到AI组和PIERT组的胶原排列不规则、胶原结构发生改变，这些改变说明了损伤的存在或者没有愈合。

骨腱结合部损伤在修复过程中会有瘢痕形成，导致细胞密度下降和分布不均，AI和PIERT组的细胞密度仅为CON组的52.70%(P＜0.05)和44.91%(P＜0.05)，但是在这两组之间比较没有显著性差异，说明与正常组织相比，其纤维软骨带局部的细胞数量减少、瘢痕组织增多。从纤维软骨带厚度来看，PIERT组的纤维软骨带厚度明显增厚，分别是CON组的133.27%(P＜0.01)和 AI组的157.78%(P＜0.01)。PIERT组在载荷刺激下其纤维软骨带厚度产生了明显的改变，结合PIERT组Tb.Th明显小于AI组的结果，提示本研究所采用的损伤造模方法导致机体保护性地减少受伤肢体的使用，受力减少造成Tb.Th增大、纤维软骨带厚度减少;而伤后训练的应力作用明显逆转了这一趋势。由此认为，伤后低强度应力作用对损伤导致的应力改变有明显影响，但是这种作用产生的牵拉力也是导致骨腱结合部损伤的主要原因，由此可以推测应该存在一个合理强度范围，用此强度进行伤后训练会获得促进损伤愈合的效果。

4 结论

1)本研究成功通过针刺方式在兔髌骨骨腱结合部建立微细损伤动物模型，从骨微细结构、组织学的不同角度证实该损伤在伤后四周仍未愈合。

2)到第四周，伤后48h开始低强度循环载荷没有明显加重所建立损伤部位的损伤程度，提示合理伤后早期恢复训练具有可行性。具体关系有待进一步研究。

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Effects of Early Return to Training on Bone-tendon Junction Post-acute Micro-injury Healing

WANG Lin1，GAO Weiwei1，XIONG Kaiyu1，LIU Ning1，WANG Bo1，
LIANG Ge1，XU Bin1，WEN Chunyi2，LÜ Weijia2
(1.Beijing Sport University，Beijing 100084，China;
2.Department of Orthopaedics and Traumatology，The University of Hong Kong)

Bone-tendon junction(BTJ)overuse injuries are common athletic problems.We studies the effects of acute injury on the healing process by low intensity training after resuming training within 48 hours post-injury，as is often the case for athletes.Twelve mature female rabbits were assigned into one of the following groups:acute injury(AI，n=6)，post-injury early return to training(PIERT，n=6)and normal control(CON，n=6).Tissue specimens were harvested at the fourth week.The trabecular thickness of the PIERT animals was significantly less than those of the AI and CON groups.A histological evaluation revealed poor collagen fibre alignment，extensive scar tissue and lowered cell density in the AI and PIERT groups compared with the CON group，but no significant differences were observed between the AI group and the PIERT group.The fibrocartilage zone thickness in the PIERT group was significantly different from those in AI group.No differences were observed in the Total VOI volume(TV)，Object volume(OBV)，Percent object volume(BV/TV)and trabecular number(Tb.N)among the AI，PIERT and CON groups.In conclusion，a repeatable animal model of bone-tendon junction acute micro-damage by puncture was established.Resuming training in 48 hours did not significantly deteriorate the BTJ injury，and improved bone and fibrocartilage zone remodelling.

bone-tendon junction;patella;quantitative loading;early return to training;injury healing

G804.23

A

1004-0560(2011)05-0060-04

2011-08-22;

2011-09-21

国家自然科学基金支持项目(编号:30871209)。

王 琳(1959-)，男，教授，主要研究方向为运动损伤机理及预防。

高维纬(1954-)，男，教授，主要研究方向为运动训练的生物学监控与运动性伤病的流行病学。

责任编辑:乔艳春

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