响应面法玉米蛋白肽锌制备条件的优化

唐军虎，康玮丽，任志艳，敬思群

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)

响应面法玉米蛋白肽锌制备条件的优化

唐军虎，康玮丽，任志艳，敬思群*

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046)

以玉米蛋白粉为原料，碱性蛋白酶酶解制得玉米肽，与硫酸锌螯合后，得到玉米蛋白肽锌。根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，运用Minitab15.0数据统计分析软件，采用三因素三水平的响应面分析法优化制备玉米蛋白肽锌的工艺。结果表明:最佳的制备条件为反应时间90min、pH为5、温度63℃、蛋白肽与锌的摩尔比为2∶1，在此条件下，螯合率为57.9%。

玉米蛋白肽锌，制备，响应面分析法，优化

玉米蛋白粉 由新疆天达生物有限公司提供;玉米醇溶性蛋白 实验室自制;碱性蛋白酶 北京诺维信公司;化学试剂 均为分析纯。

微型高速万能试样粉碎机，数显鼓风干燥箱，水浴锅，酸度计，离心机，电子天平，凯氏定氮仪，冷冻干燥机等。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的酶解 玉米醇溶蛋白→90℃热变性处理→冷却至50℃→调pH至9.0→加入碱性蛋白酶→酶解5h→灭酶(90℃/20min)→离心(5000r/min)→玉米蛋白酶解液

1.2.2 玉米蛋白肽锌的制备

1.2.2.1 玉米蛋白肽锌的工艺流程 玉米蛋白酶解液→测水解度→加入ZnSO4→搅拌→调节温度→调节pH→螯合→浓缩→冷冻干燥→玉米蛋白肽锌

1.2.2.2 玉米蛋白肽锌制备的单因素实验 以玉米蛋白肽锌的螯合率作为指标，分别考察pH、温度、反应时间、蛋白肽与锌的摩尔比四个因素对玉米蛋白肽锌制备的影响，每个因素设定5个梯度，进行单因素实验。

1.2.2.3 玉米蛋白肽锌制备条件的优化 本实验根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以pH、温度、蛋白肽与锌的摩尔比三个因子为自变量(分别以X1，X2，X3表示)，以螯合率(%，以A表示)为响应值设计了三因素三水平共15个实验点的响应面分析实验，15个实验点分为12个析因点和3个零点，实验因素水平如表1。

表1 实验因素水平表

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 玉米蛋白肽锌的定性分析 采用硫化钠法。

1.2.3.2 过氧化值(POV)的测定 采用 GB/ T5009.37-2003测定样品中的POV值。

1.2.3.3 螯合率测定 取10mL螯合液，按1∶8的体积比加入80mL的无水乙醇，经充分搅拌后离心，用EDTA滴定上层的醇层［5］。

螯合率(%)=(金属离子总量-游离离子含量)/金属离子总量×100%=C(V2-V1)/CV2× 100%=(V2-V1)/V2×100%

其中:C-EDTA的摩尔浓度;V1-滴定未螯合金属离子所用EDTA的体积;V2-滴定总加入金属离子所用EDTA的体积;

1.2.3.4 锌含量的测定 采用EDTA滴定法。

2 结果与分析

2.1 玉米蛋白肽锌制备条件的优化

2.1.1 pH对玉米蛋白肽锌螯合率的影响 pH条件是影响多肽螯合微量元素形成螯合物的重要因素。在pH较低的酸性条件下，H+将与锌离子竞争供电子基团，不利于多肽微量元素螯合物的生成:在pH较高的条件下，羟基与供电子基团争夺了锌离子而优先生成氢氧化锌沉淀。

选取pH4.5～6.5，温度50℃，时间1h，蛋白肽与锌盐的摩尔比2∶1的条件下，探讨pH对螯合反应的影响，结果如图1所示。

图1 pH对玉米蛋白肽锌螯合率的影响

由图1可知，pH偏高或偏低都会对螯合率产生较大的影响，在pH为5.5左右时，螯合率最高，因此，采用pH5.0、5.5、6.0进行后续的响应面分析实验。

2.1.2 蛋白肽与锌的摩尔比对玉米蛋白肽锌螯合率的影响 在温度50℃，时间1h和pH 5.0时，探讨蛋白肽与锌的摩尔比对螯合反应的影响，蛋白肽的摩尔数取蛋白肽水解液中的游离氨基的摩尔数，结果见图2。

由图2可知，蛋白肽与锌的摩尔比对螯合反应的影响很大，当比值过大时，蛋白肽锌的螯合率较小，且造成原料浪费;过小，则不利于螯合反应的进行。当比值为2∶1时，螯合率最大。因此实验中选取摩尔比值为1∶1、2∶1、3∶1进行后续的响应面分析实验。

图2 蛋白肽与锌的摩尔比对玉米蛋白肽锌螯合率的影响

2.1.3 反应时间对玉米蛋白肽锌螯合率的影响 选取温度50℃，pH 5.5，蛋白肽与锌的摩尔比为2∶1进行反应时间对螯合反应影响的实验，结果如图3所示。

图3 反应时间对玉米蛋白肽锌螯合率的影响

从图3可以看出，在螯合反应的前60min，螯合率虽有增加，但是增长不大，当反应进行到90min以后，螯合率变化趋于稳定，因此，在后续的实验中，选择90min作为反应条件，并且不将反应时间作为响应面分析法的考察因素。

2.1.4 温度对玉米蛋白肽锌螯合率的影响 在时间90min，pH5.5时，蛋白肽与锌的摩尔比为2∶1的条件下，进行温度对螯合反应影响实验，结果见图4。

图4 温度对玉米蛋白肽锌螯合率的影响

由图4可以看出，温度对螯合反应有显著的影响。螫合率随着温度的增加而升高，当温度达到60℃后，螯合率变化趋于平缓，因此，在研究中选50、60、70℃进行后续的响应面分析实验。

2.1.5 响应面法优化玉米蛋白肽锌的制备条件 实验以随机次序进行，以螯合率作为响应值用Minitab15.0程序进行分析，并得出响应面分析图、回归拟合方程以及方差分析表。响应面实验设计与结果见表2。

利用Minitab15.0软件对实验数据进行分析，由表3得出拟合二次多项式方程为:

表4 方差分析

表2 三因素三水平中心组合实验方案及结果

表3 三因素三水平中心组合参数估计

由表3可知，对方程影响显著程度由大到小依次为摩尔比、温度、pH，温度和摩尔比对方程影响最显著，说明这二者直接关系螯合率的大小，而pH的影响在一定范围内并不是很显著，并且得知方程大多数一次项、二次项、交互项的影响都是显著的，各因素之间不是简单的线性关系，而是二次关系。

由表4可知，模型的回归显著，交互作用较好;失拟项F值很小，表明该方程对实验拟合情况好，实验误差小。因此可以用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。

同时做出中心组合设计实验所得的三组响应面曲面图(图5～图7)。响应面图形是特定的响应值Y对应的因素X1、X2、X3构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。图中可看到拟合曲面有最大值，对拟合方程求偏导，可得出模型最大值，即为最优的实验方案。

图5 pH和摩尔比对螯合率影响的响应面分析

图6 pH和温度对螯合率影响的响应面分析

图7 温度和摩尔比对螯合率影响的响应面分析

为了进一步确证最佳点的值，利用上述分析进行最优工艺的推导，对回归方程取一阶偏导数为零并整理得:

联立上述三个方程求解，得到 X1=-0.1390，X2=0.2829，X3=0.2161。换算后得到最佳工艺条件是pH为5.4、温度62.83℃、摩尔比为2.2∶1。可得螯合率的预测值为58.3%。

为了验证响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件再重复实验3次，考虑到实际操作的便利，将工艺参数修正为:pH为5、温度63℃、摩尔比为2∶1。在此条件下玉米蛋白肽锌的螯合率达到57.9%，相对误差为0.6%，证明了方程可靠性与响应面分析法的有效性。

2.2 硫化钠法鉴定分析的结果

氨基酸螯合物是氨基酸基团中的C和N原子与金属离子配位，形成环状的螯合分子结构。金属硫化物的稳定常数远大于螯合物的稳定常数，当加入硫化钠时，S2-与稳定螯合物中的金属离子反应，生成了更稳定的金属硫化物沉淀，从而使螯合物中的氨基酸或肽游离出来，与茚三酮发生显色反应，可以利用这一性质来对样品进行定性鉴定［6-7］。

把不加硫化钠的样液加热至沸腾，用茚三酮试剂检测，溶液颜色没有发生改变;加入过量的硫化钠用玻璃棒搅匀静置一段时间后，溶液中有白色沉淀生成;过滤后滤液用茚三酮试剂检测，滤液变为蓝紫色。即原待测物质的溶液中没有游离的蛋白肽，在生成金属无机盐沉淀后，又有了游离的蛋白肽。这说明待测物质是蛋白肽和金属形成的一种特殊物质，它不像蛋白肽金属盐那样在水中以离子状态存在，也不像无机沉淀那样不溶于水，即其稳定性大于可溶性无机盐，而小于无机沉淀。初步判断该物质为玉米蛋白肽锌螯合物。

3 结论

硫化钠法鉴定分析结果表明，本研究所制备螯合物是玉米蛋白肽锌。

本实验根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以pH、温度、蛋白肽与锌的摩尔比三个因子为自变量，采用响应面分析法，得到回归方程，研究这3个因子的主效应和交互效应对产品质量的影响，以得到提高产品质量的最佳参数，使原料得到充分的利用。玉米蛋白肽锌的最佳制备工艺为:pH为5、温度63℃、摩尔比为2∶1，反应时间为90min，在此条件下螯合率可以达到57.9%。

［1］B Kong，Y L Xiong.Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action［J］.Agric Food Chem，2006(54):6059-6068.

［2］吴茹怡，叶剑明.氨基酸螯合矿物质的研究进展［J］.四川食品与发酵，2004，40(12):28-31.

［3］A AFOO.Official Publication［M］.Assoc Amer Feed Control Office Inc，2001:282-283.

［4］李庭，熊华，等.米蛋白肽锌对油脂稳定性的影响及其抑菌活性的研究［J］.食品工业科技，2009(6):65-68.

［5］张红浸，陈国松，仪明君，等.复合氨基酸铜螯合物的研究［J］.氨基酸和生物资源，2002，24(2):37-40.

［6］吴茹怡，曾里，曾凡骏.氨基酸螯合物鉴定方法的研究［J］.食品科技，2006(3):104-108.

［7］张亚丽，徐忠.酶法复合氨基酸钙络合物制备及应用研究［J］.食品科技，2000(6):8-12.

Optimization of the preparation of corn-peptide-zinc

TANG Jun-hu，KANG Wei-li，REN Zhi-yan，JING Si-qun*
(College of Life Sciences＆Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

Corn peptide was obtained via alkali protein enzyme enzymolysis with corn gluten meal as raw material，and then chelated with ZnSO4and corn-peptide-zinc(CPZ)was produced.The preparation process of CPZ was optimized according to Box-Behnken central composition design principle.The method of response surface analysis with 3 factors and 3 levels combined with Minitab15.0-statistical data analysis software was adopted. According to the above results，the optimum preparation conditions were obtained as follows:reaction time 90min，pH5，temperature 63℃，mol ratio 2∶1.Under these conditions，the chelating rate was up to 57.9%.

corn-peptide-zinc;preparation;response surface methodology(RSM);optimization

TS255.1

B

1002-0306(2011)03-0294-04

玉米蛋白粉(Corn gluten meal，CGM)是玉米淀粉生产味精的副产品。据官方统计，新疆玉米种植面积约800万亩，产地分布南北疆各地，年产量可达360～400万t。新疆天达生物工程有限公司以玉米为原料，现年产味精3.6万t，同时产生蛋白粉4200t，经本实验室测定玉米蛋白粉中蛋白质含量高达61.5%，是制备玉米短肽、氨基酸的良好原料，具有极大的开发价值［1-2］。近年来，出现了有关于植物蛋白为原料，生产具有稳定性好、吸收率高、生物效价高、毒性小等优点的小肽螯合盐的报道［3-4］，但玉米蛋白肽锌的研究尚未见报道。在玉米蛋白肽锌的制备过程中，螯合条件的确定是至关重要的。传统的正交实验虽然能够同时考虑几种因素，并确定最佳组合，却不能找出因素和响应值之间的函数关系，即回归模型，从而无法找到全部水解因素的最佳组合和响应值的最优值。本研究通过Minitab15.0软件，采用响应曲面法优化酶解玉米蛋白制备玉米蛋白肽锌的工艺，通过建立数学模型，以期获得最优的生产工艺参数，获得最佳制备工艺，为玉米蛋白肽锌的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2010-03-26 *通讯联系人

唐军虎(1984-)，男，硕士研究生，研究方向:食品科学。

新疆维吾尔自治区科技科技支疆项目资助(200991236)。