豆豉中乙酰胆碱酯酶抑制剂的提取与富集工艺研究

宋 庆，张赟彬

(1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234; 2.上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海200235)

豆豉中乙酰胆碱酯酶抑制剂的提取与富集工艺研究

宋 庆1，张赟彬2，*

(1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海200234; 2.上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海200235)

研究单因素实验优化豆豉中乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂的提取工艺。粗提液依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并对石油醚萃取相选用七种不同型号的大孔吸附树脂富集，通过Ellman法对豆豉提取物体外AchE抑制能力进行测定。结果表明，最佳提取工艺为:提取时间60min，乙醇浓度80%，温度70℃，固液比1∶10时，1.0mg/mL的豆豉提取液对AchE的抑制率为52.33%;各有机溶剂的萃取组分在1.0mg/mL时的AchE抑制率分别为:石油醚组分75.52%、二氯甲烷组分61.00%，乙酸乙酯组分70.84%和正丁醇组分26.73%;HZ-801型大孔树脂具有较好的吸附性能，最佳富集工艺为:静态吸附3.0h，吸附饱和的树脂以80%乙醇动态洗脱，洗脱流速1.0mL/min，富集后的洗脱液对AchE抑制率达83.67%。

豆豉，萃取，乙酰胆碱酯酶抑制剂，大孔吸附树脂

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆豉 购于徐汇区漕河泾菜场，产地为重庆永川;无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等 国药集团，分析纯;乙酰胆碱酯酶(AchE)、硫代乙酰胆碱(ATch)、二硫二硝基苯甲酸(DTNB)、十二烷基硫酸钠(SDS)sigma公司。

DJ灵巧型粉碎机 上海淀久中药器械制造有限公司;754紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;电热恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;冷冻真空干燥机上海照生有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 乙酰胆碱酯酶抑制剂的测定方法的建立

1.2.1.1 实验原理 根据Ellman的方法［5］，底物硫代乙酰胆碱(ATch)在乙酰胆碱酯酶(AchE)作用下分解，生成硫代胆碱(Thiocholine)，硫代胆碱与显色剂DTNB迅速作用，生成在412nm处有光吸收的黄色物质，在酶催反应的稳态阶段，其OD值即可代表起始反应速率。

1.2.1.2 豆豉提取液中AchE抑制率的测定［6］在试管中加入2900μL的PBS，20μL 1.0U/mL的乙酰胆碱酯酶和100μL稀释到一定浓度的豆豉提取物，37℃预热 10min，然后依次加入 15mmol/L的 DTNB 50μL，15mmol/L的 ATch 50μL，37℃ 水浴反应20min，加入1.0mL的4%SDS终止反应，迅速测其412nm的OD值，记为A样品，每个样品作3个平行，取平均值。由于豆豉提取物多有颜色，所以每次实验同时做一个本底扣除，即用20μL PBS代替乙酰胆碱酯酶，记为A本底;因豆豉提取物用10%乙醇溶液溶解，可能乙醇溶液本身就会导致乙酰胆碱酯酶失活，所以以10%乙醇代替提取物作为对照，记为A对照;再做空白对照组，即用100μL PBS代替豆豉提取物，记为A空白。

抑制率的计算公式:

1.2.2 豆豉提取液的制备

1.2.2.1 样品的预处理 豆豉真空干燥后，用粉碎机粉碎，过60目筛，密封保存备用。

1.2.2.2 豆豉不同溶剂提取液的制备 在3个锥形瓶中分别装入10.0g冻干豆豉粉末，分别加入水、甲醇和无水乙醇100mL，在30℃下振荡(120r/min)提取2h。将提取液于4000r/min离心20min，上清液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，冷冻真空干燥后4℃保存备用，样品用100mmol/L pH 8.0的PBS稀释至一定浓度梯度。

1.2.2.3 豆豉不同时间提取液的制备 在8个锥形瓶中分别装入10.0g豆豉粉末，然后分别加入无水乙醇100mL，在30℃下分别振荡(120r/min)提取15、30、45、60、120和240min。后处理同1.2.2.2。

1.2.2.4 豆豉不同固液比提取液的制备 在4个锥形瓶中分别装入10.0g豆豉粉末，分别加入无水乙醇50、100、150和200mL，在30℃下振荡(120r/min)提取60min，后处理同1.2.2.2。

1.2.2.5 豆豉不同乙醇浓度提取液的制备 在4个锥形瓶中分别装入10.0g豆豉粉末，然后分别加入40%、60%、80%和100%(体积比)的乙醇水溶液100mL，后处理同1.2.2.2。

1.2.2.6 豆豉不同温度提取液的制备 在5个锥形瓶中分别装入10.0g豆豉粉末，然后分别加入80%的乙醇水溶液100mL，分别在30、50、70和90℃的温度下提取60min，后处理同1.2.2.2。

1.2.2.7 豆豉粗提液的萃取处理 称取豆豉粉末100.0g，按照优化的提取工艺制备粗提液，将粗提液减压浓缩，得到的浸膏依次用石油醚(100×3)、二氯甲烷(100×3)、乙酸乙酯(100×3)和正丁醇(100× 3)萃取，合并各萃取液。将各萃取液用旋转蒸发仪浓缩成浸膏后冷冻真空干燥至粉末，然后用10%乙醇将各组分稀释成1.0mg/mL溶液。按照1.2.1.2测定各萃取组分对乙酰胆碱酯酶的抑制率。

1.2.3 大孔树脂富集豆豉提取液中乙酰胆碱酯酶抑制剂

1.2.3.1 大孔树脂的选择 分别取预处理过的D3520、NKA-Ⅱ、H103、NKA-9、ADS-7、HZ-801和HZ-818型大孔树脂各1.0g于锥形瓶中，加入上样液50mL，置于摇床中振荡过夜(20℃，120r/min)，过滤，测定滤液中乙酰胆碱酯酶抑制剂的浓度;选择吸附效果较好的大孔树脂，待其吸附饱和后过滤，树脂用去离子水清洗，然后放回锥形瓶中，加入80%的乙醇50mL，置于摇床中振荡过夜(20℃，120r/min)，过滤，测定洗脱液中乙酰胆碱酯酶抑制剂的浓度。按下式计算大孔树脂对乙酰胆碱酯酶的吸附率与解吸率:

式中:I前，I后分别为吸附前后上样液对乙酰胆碱酯酶的抑制率;I解为解吸液对乙酰胆碱酯酶的抑制率。

1.2.3.2 HZ-801大孔树脂静态吸附动力学曲线 称取处理好的HZ-801大孔树脂3份，每份1.0g，于150mL的锥形瓶中，加入上样液50mL，置于摇床中振荡，每30min从溶液中取样，测定溶液对乙酰胆碱酯酶的抑制率。

1.2.3.3 乙醇浓度对解吸的影响 取吸附饱和的HZ-801大孔树脂5份，每份1.0g，于150mL的锥形瓶中，用浓度为60%、70%、80%、90%和100%的乙醇进行解吸，解吸完全后，测定相关溶液对乙酰胆碱酯酶的抑制率，计算出解吸率。

1.2.3.4 大孔树脂的动态解吸 将吸附饱和的HZ-801大孔树脂100.0g装入层析柱中，然后以80%乙醇溶液以0.5、1.0、1.5、2.0mL/min的流速洗脱，确定最佳流速。解吸液每50mL为一流分，并测定每个流分对乙酰胆碱酯酶的抑制率。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

2.1.1 不同溶剂的豆豉提取液对AchE的抑制率

结果表明，用乙醇作为豆豉的提取溶剂，提取液浓度在1.0mg/mL时对AchE的抑制率较高，而水提液对AchE的抑制率很低，可以粗略地判断提取液中有效成分为弱极性或者非极性物质，因此选择乙醇作为提取溶剂。

表1 不同溶剂的豆豉提取液对AchE的抑制率(1.0mg/mL)

2.1.2 不同时间的豆豉提取液对AchE抑制率的影响 实验表明，在60min前，提取物中乙酰胆碱酯酶抑制物的含量随着提取时间的延长逐步增加，60min后，提取物对AchE抑制率逐渐下降，可能是随着提取时间增加，提取液中非AchE抑制成分的含量增多，导致提取物浓度在1.0mg/mL时的有效成分相对含量降低，综合考虑，确定最佳提取时间为60min。

图1 不同时间的豆豉提取液对AchE抑制率的影响(1.0mg/mL)

2.1.3 不同固液比的豆豉提取液对AchE抑制率的影响 实验表明，在固液比大于1∶10时，豆豉提取液对AchE抑制率基本保持不变，考虑到提取操作的经济性，确定固液比为1∶10时可以有效地提取豆豉中有效活性物质。

图2 不同固液比的豆豉提取液对AchE抑制率的影响(1.0mg/mL)

2.1.4 不同乙醇浓度的豆豉提取液对AchE抑制率的影响 实验表明，随着乙醇浓度的变化，提取液对AchE抑制率变化有一个先上升后下降的趋势;在乙醇浓度为80%时，豆豉提取液对AchE抑制率最高。乙醇水溶液作为提取溶剂，其中，水的存在能帮助渗透豆豉组织，提高渗透性，更易于有效成分溶于溶剂体系中，从而游离到胞外。80%的乙醇对豆豉中AchE抑制成分的提取效果较好。

图3 不同乙醇浓度的豆豉提取液对AchE抑制率的影响(1.0mg/mL)

2.1.5 不同温度下的豆豉提取液对AchE抑制率的影响 实验表明，随着温度升高，豆豉提取液对乙酰胆碱酯酶抑制剂的浓度逐渐增加，说明豆豉中的AchE抑制成分热稳定性较好，因此确定提取最适温度为70℃。

图4 不同温度下的豆豉提取液对AchE抑制率的影响(1.0mg/mL)

以上实验结果表明，通过对提取溶剂、提取时间、固液比、乙醇浓度、提取温度等单因素实验，确定提取工艺为:浸提时间为60min，固液比为1∶10，乙醇浓度为80%，温度为70℃;该提取工艺更易于豆豉中AchE抑制成分的提取，在该工艺条件下，浓度为1.0mg/mL的豆豉提取液对AchE抑制率为52.33%。

2.1.6 各有机溶剂萃取组分对AchE的抑制率 实验结果表明，前三种萃取组分对AchE的抑制率都较强，其中以石油醚萃取相活性最高，其具体的化学成分还有待进一步分析。已有的文献报道表明［7］，脂肪酸，甘油酯，长链烃类化合物，极性小、含氧取代低的萜类、甾体，生物碱等是石油醚萃取相中的主要组成成分，并且已有多种生物碱类和萜类被报道具有AchE抑制活力，后续实验将重点对石油醚萃取相进行富集和进一步分离纯化。

表2 各有机溶剂萃取组分对AchE的抑制率(1.0mg/mL)

2.2 大孔树脂对石油醚相中乙酰胆碱酯酶抑制剂的富集

2.2.1 静态吸附法筛选大孔树脂 选择极性不同的7种大孔树脂对石油醚相中乙酰胆碱酯酶抑制剂富集，综合吸附率与解吸率筛选性能较好的树脂，实验结果表明，HZ-801对石油醚相中的AchE抑制剂的静态吸附及解吸性能都较好，优于其他几种树脂，是富集乙酰胆碱酯酶抑制剂较理想的吸附剂。

表3 不同吸附树脂对AchE抑制剂的吸附率和解吸率

2.2.2 HZ-801大孔树脂静态吸附动力学曲线 树脂对石油醚相中乙酰胆碱酯酶抑制剂的吸附特性不仅表现在吸附量和选择性上，其吸附速度也是重要的影响因素。实验结果表明，乙酰胆碱酯酶抑制剂在HZ-801大孔树脂上经过3.0h后基本达到吸附平衡，平衡时的吸附率为85.44%，因此在以后的实验中应使吸附时间大于3.0h，以确保吸附平衡。

图5 静态吸附动力学曲线

2.2.3 乙醇浓度对解吸性能的影响 实验表明，随着乙醇浓度的升高，解吸率也随之升高，当乙醇浓度达到80%以上后，解吸率上升缓慢，考虑到乙醇的用量，做到降低富集的成本，确定用80%的乙醇作为乙酰胆碱酯酶抑制剂的解吸液，解析率为88.12%，解吸液对AchE抑制率为81.89%。

图6 乙醇浓度对解吸的影响

2.2.4 流速对解吸性能的影响 实验结果表明，以80%的乙醇溶液为洗脱液，解吸率随流速的增高而降低，以0.5mL/min和1.0mL/min洗脱时，洗脱效果较好，考虑到实验效率，因此选用1.0mL/min的流速进行洗脱为宜，解析率达到91.03%，解吸液对AchE抑制率达83.67%。相对静态解吸有明显提高，见图7。

2.2.5 动态解吸曲线 实验结果表明，乙醇溶液以1.0mL/min洗脱时，乙酰胆碱酯酶抑制剂迅速被洗脱下来，洗脱液通过500mL后，吸附在树脂上的乙酰胆碱酯酶抑制剂基本洗脱下来，解吸曲线出峰快，且无明显拖尾现象。详见图8。

3 结论

3.1 用不同溶剂(水、甲醇、乙醇)提取豆豉，乙醇提取物对AchE的抑制率最高。

图7 不同流速对解吸的影响

图8 动态解吸曲线

3.2 提取时间、固液比、乙醇浓度、提取温度对豆豉中AchE抑制成分的提取都存在影响，最佳提取工艺为:浸提时间为60min，固液比为1∶10，乙醇浓度为80%，温度为70℃;浓度为1.0mg/mL的豆豉提取液对AchE抑制率最高为52.33%。

3.3 粗提液经下述有机溶剂进一步萃取，石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯组分对AchE抑制率较强，分别为: 75.52%、61.00%、70.84%;正丁醇组分对AchE抑制率较弱为:26.73%。

3.4 通过筛选大孔树脂对石油醚相中的乙酰胆碱酯酶抑制剂进行富集，综合吸附性能与解吸性能，选择HZ-801大孔树脂富集乙酰胆碱酯酶抑制剂。HZ-801大孔树脂3.0h后吸附饱和，其动态解吸性能比静态解吸性能好。吸附饱和的树脂以80%乙醇、1.0mL/min洗脱时，解吸率达到91.03%，洗脱液对AchE抑制率达83.67%。解吸曲线出峰快，且无明显拖尾现象。

［1］李前，朱振霞，孙曼霁.乙酰胆碱酯酶与老年性痴呆关系的研究进展［J］.中国老年学杂志，2002，22(4):325-326.

［2］陈科茂.乙酰胆碱酯酶抑制剂药物“激活”老年痴呆症市场［J］.中国医药情报，2004，10(6):48.

［3］Ibach B，Haen E.Acetylcholinesterase Inhibition in Alzheimer’s Disease［J］.Current Pharmaceutical Design，2004，10:231-251.

［4］管立军，程永强，李里特.腐乳和豆豉功能性研究进展［J］.中国实物与营养，2008(11):48-51.

［5］Ellman G L，Courtney K D，Andres V Jr，et al.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity［J］.Biochem Pharmacol，1961，7:88-95.

［6］张翼，冯妍，李晓明，等.海藻组分抑制乙酰胆碱酯酶活性研究［J］.海洋与湖沼，2005，36(5):459-463.

［7］Faulkner D J.Marine natural products［J］.Natural Product Reports，2001，18(1):1-49.

Extraction and enrichment technique of acetylcholinesterase inhibitor from Douchi

SONG Qing1，ZHANG Yun-bin2，*
(1.College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China; 2.School of Perfume and Aroma Technology，Shanghai Institute of Technology，Shanghai 200235，China)

Extraction of acetylcholinesterase(AchE)inhibitor from Douchi was optimized through single factor experiment.Crude extract was extracted by petroleum ether，methylene chloride，ethyl acetate and n-butanol extract in turn，and the petroleum ether fraction was enriched with macroporous resin.Ellman’s method was used to determine AchE inhibitory activity in vitro.The results showed that the optimum extraction condition were with the extract time of 60min，ethanol concentration of 80%，extraction temperature of 70℃，ratio of liquid/solid of 1∶10. 1.0mg/mL of Douchi extract showed 52.33%AchE inhibition rate.Crude Douchi extract was further extracted.The AchE inhibition rate of 1.0mg/mL extract by following solvent was as follows:75.52%by petroleum ether，61.00%by methylene chloride，70.84%by ethyl acetate and 26.73%by n-butanol.HZ-801 macroporous resin was selected to enrich acetylcholinesterase inhibitor.The optimum enrichment conditions were absorbed time of 3.0h，elution solvent of 80%ethanol，and 1.0mL/min elution rate.After enrichment，the AchE inhibition rate could reach 83.67%.

Douchi;extract;acetylcholinesterase inhibitor;macroporous resin

TS214.9

B

1002-0306(2011)03-0285-04

乙酰胆碱酯酶(acetylchlinesterase，AchE)是老年痴呆疾病阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)的一个酶抑制剂作用靶点，AchE催化乙酰胆碱的裂解反应，导致乙酰胆碱的缺失，直接造成神经信号传递失败，引起老年痴呆症［1］。如今，随着人口老龄化速度的快速增加，AD病人日益增多，已经成为继心血管疾病和肿瘤之后严重威胁老年人生命健康的主要疾病之一。据预测，我国在21世纪中叶，60岁以上的老龄人口将达到4亿左右，并将成为世界上老年人口最多的国家［2］。而应用于临床的AchE抑制剂大多存在半衰期短、较严重的外周胆碱能系统副作用等缺点，不利于患者长期服用［3］。所以从大自然中开发、寻找具有适宜患者长期服用、毒副作用小、作用面广等优点的AchE抑制剂受到科学研究者们的广泛关注。豆豉作为中国的一种传统大豆发酵食品在南方地区深受老百姓的喜爱，它的营养价值极高。制作及食用豆豉在我国已有上千年历史。豆豉具有较好的生理功能，已见报道的有预防糖尿病、抗氧化、降血压、溶血栓、抗老年痴呆等作用［4］。本文探讨了豆豉中AchE抑制剂的提取以及大孔树脂对其富集工艺研究，为开发新型、适宜患者长期服用、毒副作用小的治疗老年痴呆症的药物打下基础。

2010-03-09 *通讯联系人

宋庆(1984-)，男，硕士研究生，研究方向:天然产物化学。

上海市自然科学基金项目(08CR1418900)。