酶法提取茶树修剪叶中的蛋白及其性质研究

李 言，章海燕，胡 敏，王 立，张 晖，姚惠源

(江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214036)

酶法提取茶树修剪叶中的蛋白及其性质研究

李 言，章海燕，胡 敏，王 立*，张 晖，姚惠源

(江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214036)

以蛋白的提取率为指标，利用Alcalace、果胶酶和纤维素酶在缓冲液条件下对茶树修剪叶中蛋白的提取进行了研究，发现这三种酶均能有效提高蛋白质的提取率，利用果胶酶和纤维素酶分别与Alcalace合用发现，纤维素酶和Alcalace合用能够很明显提高蛋白质的提取率，比单用Alcalace或纤维素酶分别提高了近35%和近50%。对利用Alcalace和纤维素酶协同作用得到的茶叶蛋白进行分析发现，利用碱法和酶法提取对于蛋白质的氨基酸组成基本没有影响，除吸水性和起泡稳定性略差于碱提茶叶蛋白外，酶法提取茶叶蛋白的其它指标如吸油性、乳化性、乳化稳定性以及起泡性均优于碱提茶叶蛋白。

茶树修剪叶，蛋白质，提取，酶法

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶树修剪叶 2009年6月取自江苏省溧阳市天目湖玉枝特种茶果园艺场，去除枝条后风干，粉碎，过20目筛，备用(蛋白质含量为22.8%，茶多酚含量为21.78%，茶叶总糖含量为23.51%，水分含量为5.85%);碱性蛋白酶Alcalace 诺维信(中国)生物医药有限公司，活力 240000U/g;果胶酶(活力30000IU/g)、纤维素酶(活力10000IU/g) 江苏无锡酶制剂厂;其余试剂 均为分析纯。

旋转蒸发器 RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂;水循环真空泵 SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司;定时恒温磁力搅拌器 94-2，上海志威电器有限公司;可见分光光度计 UV1100，北京瑞利分析仪器厂;双光束紫外可见分光光度计 TU-1900，北京普析通用仪器有限责任公司;ECP3000型三恒多用电泳仪 山东省龙口市先科仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蛋白提取工艺 酶法提取蛋白是利用蛋白酶对蛋白的降解和修饰作用，使其变成可溶的肽而被抽提出来。酶法提取反应条件比较温和，蛋白质多肽链可水解为短肽链，能够提高蛋白质的消化率，同时其反应的液固比小，不仅节省了碱(传统方法一般是利用碱来提取蛋白质)和水的消耗量，而且提高了提取液中的固形物含量，从而降低了除去提取液水分的能量消耗，为工业生产创造了条件。具体的实验步骤如下:

定量茶树修剪叶→加入酶→搅拌提取→抽滤→滤液浓缩干燥→茶叶蛋白粗品

1.2.2 茶叶蛋白性质研究

1.2.2.1 蛋白组成研究 具体方法见图1。

图1 茶叶蛋白组分分级流程图

1.2.2.2 氨基酸分析 待测含硫氨基酸的样品采取过甲酸氧化-盐酸水解法进行处理，待测其余氨基酸的样品采取盐酸水解法处理。样品水解后用氨基酸自动分析仪测定各种氨基酸的浓度。γ-氨基丁酸用2，4-二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生反相高效液相色谱紫外检测法测定［6］。

1.2.2.3 功能性质分析［7］a.持水持油能力:取1g蛋白质样品，加入10mL水或玉米油，用玻璃棒轻轻搅拌，分散至无明显颗粒，静置30min，离心(3000r/ min，20min)，倾去上清液，称重(W)。蛋白质持水性/持油(g/g)=(W-1)/1。

b.乳化及乳化稳定性:采用浊度法测定，具体操作如下:取0.5%浓度(w/v)的蛋白样品溶液40mL，加入40mL色拉油，在10000r/min转速下搅拌2min，转移入刻度离心管，3000r/min离心5min，取出读取体积。乳化能力=乳化层体积/液体总体积×100%。

将上述溶液放置 30min后，3000r/min离心5min，取出读取体积。乳化稳定性=乳化层剩余体积/乳化层初始体积×100%。

c.起泡及起泡稳定性:在缓冲溶液(pH7.0)中配制1%的蛋白质溶液，取100mL，倒入高速组织捣碎机中，在10000r/min转速下搅拌1min;转入250mL量筒，立即记录泡沫体积(V0);15、30、60min后各再次记录泡沫体积(Vt)。蛋白质的起泡性(%)= (V0-100)/100×100%，其中:t为乳状液放置时间。蛋白质起泡稳定性=(V0-Vt)/V0×100%。

2 结果与讨论

2.1 提取工艺的优化

实验组实习生的实践、理论平均成绩均明显超过了2015年实习生的实践、理论平均成绩,两项平均成绩数据差异明显,具备统计学意义(P<0.05)。

茶叶中蛋白含量为20%左右，另外含有茶多酚、茶叶多糖、木质素等物质，蛋白不可避免地与其有相互作用而导致难以提取，因此本研究中拟利用果胶酶和纤维素酶对其作用进行弱化，同时利用蛋白酶作用，从而提高蛋白的提取得率。

2.1.1 蛋白酶作用对提取效果的影响 Alcalace是一种能够水解多种蛋白质的高效细菌蛋白酶，是一种碱性内切酶，最佳pH为6.5～8.5，在本研究中控制pH为7，具体结果见表1。

从表1可以看出，随着蛋白酶用量的增加，蛋白质提取率有比较明显的提高，当蛋白酶用量从没有添加到添加量为960U/g茶叶时，蛋白质的提取率提高了近60%，而继续提高酶的用量，蛋白质的提取率没有明显的变化(仅提高1%～2%)，说明添加蛋白酶有利于提高蛋白质的提取率，但是酶用量过大的时候，蛋白酶对茶叶不溶性蛋白的水解能力不再是提高蛋白质提取率的限制因素，同时已经提取出的蛋白质被水解成更小的肽，而蛋白质的提取率没有得到提高，因此考虑蛋白酶的用量控制在 960U/g茶叶。

2.1.2 果胶酶用量对提取效果的影响 考虑到茶叶中有一定含量的果胶，而且蛋白质可能与果胶相互作用，采用果胶酶处理进行蛋白质的提取，具体结果见表2。

从表2可以看出，随着果胶酶用量的增加，茶叶蛋白的提取率随之增加，当酶用量添加到600IU/g茶叶的时候，蛋白的提取率达到了48%左右，比不添加果胶酶的提取率提高了30%左右，说明添加果胶酶有利于对树叶中的果胶进行作用［8］，从而有利于蛋白质的提取。但是当酶的用量继续增加，蛋白的提取率提高比较缓慢，可以考虑果胶酶的用量控制在600IU/g茶叶。

表1 蛋白酶用量对提取效果的影响

表2 果胶酶用量对提取效果的影响

表3 纤维素酶对提取效果的影响

表4 果胶酶和蛋白酶合用对提取效果的影响

表5 纤维素酶和蛋白酶合用对提取效果的影响

表6 茶叶蛋白质的组成

2.1.3 纤维素酶用量对提取效果的影响 树叶中不仅有果胶类物质，还含有丰富的纤维素，而且纤维素易于与蛋白质结合，导致提取效率不高。采用不同添加量的纤维素酶进行提取，具体结果见表3。

从表3可以看出，随着纤维素酶用量的增加，蛋白质的得率随之增加。当酶的用量超过400IU/g茶叶时，提取率提高不明显，可以考虑纤维素酶用量控制在400IU/g茶叶。

2.1.4 两种酶合用对提取效果的影响 比较表1～表3，发现添加这三种酶后茶叶蛋白的提取率均得到了一定的提高，其中蛋白酶的作用最好。考虑到果胶酶和纤维素酶的作用是破坏蛋白与果胶或纤维素等物质的结合，以达到释放出蛋白从而提高提取率，因此采用不同用量的果胶酶或纤维素与蛋白酶结合使用提取蛋白质，具体方案和结果见表4和表5。

2.2 茶叶蛋白性质的研究结果

2.2.1 茶叶蛋白组成分析 茶叶蛋白质的组成见表6。

从表6可以看出，茶叶蛋白中绝大部分为谷蛋白，与相关报道一致［9-10］，而这部分蛋白质在水中的溶解性比较低，因此，需要用碱提取或者利用酶水解的方法来进行提取。

2.2.2 茶叶蛋白的氨基酸分析 对酶法提取得到的茶叶蛋白进行氨基酸分析，结果见表7。

表7 茶叶蛋白的氨基酸分析

从表7可以看出，利用酶法提取茶叶中的蛋白质，提取效率要低于碱法提取，这和其他蛋白提取的结果一致［12］，分析茶叶蛋白组成也发现，其中含量较高的为谷蛋白，而该种氨基酸需要用碱法才能进行有效的提取［13］，因此也影响了酶法提取的效率。同时从结果中也可以看出，用酶法进行提取的茶叶蛋白在氨基酸组成上与碱法提取的没有显著的差异，因此尽管提取效率不同，但营养成分没有较大的变化，这也与已有的报道一致［11］。

2.2.3 茶叶蛋白功能性质分析 茶叶蛋白的功能性质见表8。

蛋白质的持水性是蛋白质水化性质中一个很重要性质，它取决于蛋白质与水之间的相互作用。蛋白质吸收和保留水的能力对于各种不同的食品，特别是肉浆和焙烤面团的质构起着重要的作用［14］。从表8中可以看出，相对于碱提茶叶蛋白，酶法提取的茶叶蛋白吸水性降低而吸油性升高，可能原因是在提取的时候添加了蛋白酶，部分茶叶蛋白被水解成氨基酸或者多肽，包裹在蛋白质内部的疏水基团暴露出来。

表8 茶叶蛋白的持水持油能力

蛋白质常被作为乳化剂用于乳状液食品体系中，如酪蛋白在冰淇淋中的应用，大豆蛋白在火腿肠中的应用。已知蛋白质的乳化能力与其溶解度、分子链的柔性以及疏水性等因素有密切关系。在不损失溶解性的前提下，蛋白质的适度热变性对其乳化能力有促进作用［14］。从表8中可以看出，酶法提取的茶叶蛋白的乳化性相比碱提茶叶蛋白提高了10%左右，而乳化稳定性则略有提高，说明碱提过程虽然对蛋白质结构有一定的破坏，但是暴露出的疏水基团还低于酶法水解后的。

蛋白质分子的双亲基团使其能定位吸附于气-水界面，形成泡沫体系。蛋白质的发泡性与其分子的柔性、疏水性、溶解性等因素有关，而泡沫的稳定性则依赖于蛋白质的带电性质和粘弹性［15］。从表8可以看出，酶法提取的蛋白质起泡性要高于碱法提取的蛋白质。虽然植物蛋白的疏水性氨基酸含量比动物来源的卵清蛋白、酪蛋白等还要高，但由于其分子的柔性较差，在搅打时不能自发和快速地吸附于新形成的界面上，因而发泡性较差。

3 结论

3.1 利用蛋白酶、果胶酶或纤维素酶可以有效地提高茶叶中蛋白质的提取得率，而且两种酶合用效果更佳，纤维素酶和蛋白酶(400IU/g茶叶+480U/g茶叶)联合使用，蛋白质提取率达到78.57%。

3.2 对得到的茶叶蛋白进行分析发现，利用碱提和酶法提取对于蛋白质的氨基酸组成基本没有影响，除吸水性和起泡稳定性略差于碱提茶叶蛋白外，酶法提取茶叶蛋白的其它指标如吸油性、乳化性、乳化稳定性以及起泡性均优于碱提茶叶蛋白。

［1］刘林，黄伟，车科，等.水酶法提取茶叶籽蛋白工艺研究［J］.江苏食品与发酵，2008(3):5-8.

［2］崔蕊静.酶法水解和常规水浸提制备绿茶浸提液工艺条件比较［J］.食品科技，2009，34(11):226-230.

［3］孙秋香，吴坷.茶叶多糖的提取方法探讨［J］.湖北第二师范学院学报，2009，26(2):36-38.

［4］Chavan V D，Mckenzie D B，Shahidi F.Functional Properties of Protein Isolates From Beach Pea［J］.Food Chem，2001，74: 177-187.

［5］Prakash J，Ramanatham G..Effect of Stabilization Treatment of Rice Bran on Functional Properties of Protein Concentrates［J］.J Sci Food Agric，1995，67:181-187.

［6］吕莹果，张晖，孟祥勇，等.2，4-二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生法测定植物中谷氨酸脱羧酶的活力［J］.分析化学，2009 (3):347-350.

［7］李雪琴，苗笑亮，裘爱泳.蚕豆分离蛋白的制备及其功能性质研究［J］.粮食与饲料工业，2003(5):41-43.

［8］张有林，韩军岐，卢琛慧，等.姜黄色素提取及防腐效果研究［J］.农业工程学报，2005(2):144-148.

［9］陈荣义，张新申，申金山，等.茶叶中有效成分综合提取的研究［J］.食品科学，2005，26(4):174-177.

［10］王瑞芳，蓝伟光，张世文，等.茶叶中有效成分的开发利用进展［J］.亚热带农业研究，2005(8):64-69.

［11］吴元锋，沈莲清，欧阳燕，等.干茶叶蛋白和新鲜茶叶蛋白性质研究［J］.食品研究与开发，2008(8):32-35.

［12］沈莲清，黄光荣，王向阳，等.茶渣中蛋白质酶法提取工艺［J］.食品与生物技术学报，2006，25(6):7-12.

［13］邹小明，谢骞，朱立成，等.茶叶蛋白的提取工艺研究［J］.江苏农业科学，2007(1):169-171.

［14］菲尼马.食品化学［M］.第三版.王璋等译.北京:中国轻工出版社，2003.

［15］石彦国，任莉.大豆制品工艺学［M］.北京:中国轻工出版社，1993.

Study on extraction of protein from pruned tea leaves by enzyme and its properties

LI Yan，ZHANG Hai-yan，HU Min，WANG Li*，ZHANG Hui，YAO Hui-yuan
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214036，China)

Protein was extracted from pruned tea leaves by Alcalace，pectinase，and cellulase，respectively.The yield increased significantly when the Alcalace，pectinase，and cellulase were used as 480，600，400IU/g，respectively. The protein yield extracted by cellulase and Alcalace was 35%higher than that extracted by Alcalace.In the same time，it was 50%higher than that extract by cellulose.The oil-holding capacity，emulsifying activity，emulsifying stability，and foaming capacity of protein extracted by enzyme were higher than those of protein extracted by alkaline，but the water-holding capacity and foam stability were lower than those of protein extracted by alkaline.

pruned tea leaves;protein;extraction;enzyme

TS201.2+1

A

1002-0306(2011)03-0127-04

中国是产茶大国，茶叶资源十分丰富，年产量约80万t，其中20～30万t为低档茶和碎茶，废料约160万t，包括在茶叶生产过程中产生的大量茶末、修剪叶、甚至滞销的粗老茶，大部分没有进一步加工而当作废料处理［1］。茶叶的化学组成极其复杂，茶的鲜叶中含有75%～80%的水分，干物质含量为20%～25%。干物质中包含了成百上千种化合物，经鉴定的已知化合物约有500多种，大致可分为蛋白质(20%～30%)、多酚(20%～35%)、生物碱(3%～5%)、氨基酸(1%～5%)、碳水化合物(35%～40%)、矿物质(4%～7%)、维生素、色素、脂肪和芳香物质等［2-3］。由于碱法提取蛋白效率高，因此目前普遍采用此法，但采用碱法提取蛋白会改变蛋白质营养学特性，而且有可能会生成赖-丙氨酸，这种物质不但有毒，而且还会引起营养物质的损失。除此之外，在高碱条件下还会产生以下不利反应:a.蛋白质变性和水解;b.加速美拉德反应，产生黑色物质;c.提取物中非蛋白含量增加，分离效果降低［4］。而酶法提取茶叶蛋白可以克服这些缺点［5］，蛋白酶能使一部分蛋白质水解成肽和氨基酸，从而提高蛋白质的溶出率，同时蛋白质酶法能够提高和改善蛋白质的溶解性、乳化性、起泡性、粘度等，还能避免酸法水解对氨基酸的破坏作用和变旋作用，以保证蛋白质质量。本研究中利用生物酶技术对茶树修剪叶中的蛋白进行提取，同时对提取出的蛋白进行了氨基酸分析和简单的功能研究。

2010-03-04 *通讯联系人

李言(1990-)，男，本科生，主要从事功能因子的研究。

江苏省农业攻关项目(BE2009414)。