血塞通注射液溶血检测方法研究△

张剑峰，项峥，窦德强

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

血塞通注射液溶血检测方法研究△

张剑峰，项峥，窦德强*

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

目的:筛选出一种较好的用于检测中药注射剂溶血的方法。方法采用肉眼观察法、红细胞计数法以及分光光度法对血塞通注射液溶血度进行测定。结果各种方法测定的结果有所差异。肉眼观察法判断没有溶血或不明显的结果，红细胞计数法和分光光度法均可测定出具体数值，且结果在溶血趋势上具有一定的一致性。红细胞计数法测定每组的RSD值均大于5%，而分光光度法则均小于5%。结论分光光度法更方便、准确，适用于中药注射剂溶血监测使用。

溶血;不良反应;分光光度法

近年来，有关临床上中药注射剂不良反应的报道屡见不鲜，寻找出既简便又有效的监测方法迫在眉睫。其中对于中药注射剂溶血性试验， 《中国药典》中规定采用肉眼观察法对注射剂溶血进行评价[1]。此法虽简便、易行，适用于溶血明显的样品，并给出定性判断，但由于其通过肉眼来观察，有时又受到注射剂本身颜色的影响及少量溶血时观察不明显，溶血情况很难判断，主观误差影响较大。因此，肉眼观察法已经不能对各种程度的溶血做出准确的判断，需寻找出一种更有效、简便的方法。据 《药物研究技术指导原则》[2]以及文献[3，4]报道， 还有红细胞计数法、分光光度法、体内溶血试验法以及乳酸脱氢酶活性测定法4种溶血测定方法，乳酸脱氢酶活性测定法用于诊断临床血液病，而非用于中药注射剂溶血检测，因此本实验未对其进行讨论研究。

由于皂苷类成分多具有溶血作用，其与血红细胞壁上的胆甾醇结合生成不溶性分子复合物沉淀，造成血红细胞正常渗透性被破坏而发生破裂，进而产生溶血[5]，因此在一定程度上影响了其临床使用。本实验以主要成分为三七总皂苷的血塞通注射液为例，分别采用红细胞计数法，分光光度法以及常规肉眼观察法对血塞通溶血度测定并对各种方法加以比较，找出有效、简便、稳定的方法，为监测中药注射剂溶血反应提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-2100分光光度计(上海 UNICO公司)，TDZ4-WS台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，Matrix CellMate II移液器，dragon-med可调式移液器(大龙医疗设备上海有限公司)，红细胞计数板，OLYMPUSBX50显微镜，HH-S型水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 试剂

氯化钠注射液(赤峰荣济堂药业有限公司，批号:09123843)，血塞通注射液(哈尔滨珍宝制药有限公司，规格:2mL∶0.1g，批号:20091108 43，20091128 41)。

1.3 动物

家兔(购于大连大学动物室)。

2 方法

2.1 实验条件

参考 《中国药典》 规定[1]以及先前实验结果[6]并经考察，确定实验条件为:1.1%血细胞悬液2.5 mL，3.5 mL不同浓度血塞通注射液及氯化钠注射液混合液，(37±0.5)℃水浴2 h后采用肉眼观察法以及血细胞计数法评价其溶血程度。以分光光度法测定同样样品时，对样品离心10 min(转速为3 000 r·min-1)，离心后取上清液，575 nm处测定吸光度[7]，同时设立阴性对照组及阳性对照组。

2.2 1.1%红细胞混悬液制备

少量玻璃珠放入洁净烧杯，将健康家兔耳缘静脉取血于其中，轻轻不断摇晃。去除纤维蛋白后，用滴管将血液移至刻度离心管中。以氯化钠注射液洗涤，离心，除去上层液体。反复操作至上清液无色澄清为止，所得的红细胞以生理盐水配制成1.1%的红细胞混悬液，并于当天用于实验，用时摇匀。

2.3 溶液配制方法

取血塞通注射液 0.1， 0.3， 0.5， 0.7， 0.9，1.1 mL，加入到不同试管中，用氯化钠注射液补充反应总体积至3.5 mL，作为供试品管。另取新鲜蒸馏水3.5 mL作为阳性对照管，氯化钠注射液3.5 mL作为阴性对照管。上述各管分别加入1.1%红细胞混悬液2.5 mL，轻轻混匀。另向新试管中加入与各试验管内相同含量的血塞通注射液，并加入适量氯化钠注射液使体积达到6 mL，作为供试品对照管。见表1。

表1 各试验组溶液配比/mL

2.4 肉眼观察法

将37℃水浴2 h后的各管取出，对阳性对照管、阴性对照管、每组供试品管及其供试品对照管进行颜色观察，通过肉眼来判断溶血情况。试管中的溶液呈澄明红色，管底无或者有少量细胞残留，表明有溶血发生;红细胞全部沉淀，且上清液无色澄明，或者有色澄明，但供试品管和阴性对照管或供试品对照管颜色无明显差异，则表明无溶血发生。

2.5 红细胞计数法

将目视法观察后的每组试管摇匀，分别吸取一滴滴于细胞计数板上(由于最终确定值为比例值，为了使数据更具有广泛性，本实验未对样品进行稀释。)。待沉降完全，在低倍镜下观察计数板内的红细胞分布是否均匀。确定均匀后把计数板中央的大方格置于视野中，将显微镜调成高倍镜观察，计数5个中方格(总共80个小方格)内的红细胞数量。为避免计数重复或遗漏，压在线上的红细胞，本实验只记录方格4条线中上侧线和左侧线。最后计算每组试验管的红细胞数与阴性管的红细胞数的比值。溶血度(%)=(1-试验管红细胞数/阴性管红细胞数)×100%。每组共做6份样品，每份样品取样2次，求平均值。最终求6份样品的平均值与RSD值，并计算溶血度。

2.6 分光光度法

根据血细胞释放出来的血红素在575 nm的条件下有最大吸收[6]，采用分光光度法测定每组样品的吸光度，来反映血塞通注射液溶血度。将37℃水浴2 h后的每组试管离心10 min(3 000 r·min-1)，后将各组试管内的上清液吸于比色皿内，在575 nm下以阴性对照管为空白，记录其余各管的吸光度。溶血度(%)=[(A试验管-A阴性管)/(A阳性管-A阴性管)]×100%，A为样品吸光度值。求出每组平均值，计算RSD值与溶血度。

3 结果

3.1 肉眼观察结果

经与阴性对照管、阳性对照管和供试品对照管对比后，相同浓度下不同批号血塞通注射液肉眼观察溶血情况大致相同，结果见表2。

表2 肉眼观察法检测血塞通注射液溶血结果

3.2 红细胞计数法溶血度测定结果

对于两种批号的血塞通注射液溶血度的测定，红细胞计数法测得的溶血度与血塞通注射液浓度呈一定的正相关性。即随着注射剂浓度的增大，溶血度增大。测得每组溶血度的RSD值均大于5%。结果见表3、4。

表3 红细胞计数法测定血塞通注射液溶血度结果(20091108 43)/%

表4 红细胞计数法测定血塞通注射液溶血度结果(20091128 41)/%

3.3 分光光度法溶血度测定结果

分别对两批血塞通注射液的溶血度采用分光光度法测定的结果表明，测得的溶血度也随着血塞通注射液的浓度增高而增高。与红细胞计数法相比，相同给药剂量下分光光度法计算出的溶血度小，且每组RSD值均小于5%。结果见表5、6。

表5 分光光度法测定血塞通注射液溶血度结果(20091108 43)/%

表6 分光光度法测定血塞通注射液溶血度结果(20091128 41)/%

3.4 3种测定方法结果比较

实验结果显示，肉眼观察判断有溶血的样品，红细胞计数法测定的溶血度均大于75%，分光光度法测定的溶血度则大于50%;肉眼判断不溶血或不确定溶血的样品，红细胞计数法测定的溶血度在0%～75%，分光光度法测定的溶血度则在0%～50%。同种方法对不同批号血塞通注射液的溶血度测定，结果差别不大;而不同方法对同一批号血塞通注射液测定，结果差异较大，但趋势相似，结果见表7。以每试管中加入血塞通注射液在整个反应体系中的浓度为横坐标，溶血度为纵坐标，分别对同种方法测定不同批号血塞通注射液、不同方法测定同一批号血塞通注射液进行作图分析，见图1～4。

表7 不同方法测定血塞通注射液溶血度结果(x±s)/%

图1 分光光度法测定血塞通注射液溶血度变化图

图2 红细胞计数法测定血塞通注射液溶血度变化图

图3 红细胞计数法与分光光度法测定血塞通注射液溶血度对比图(20091108 43)

图4 红细胞计数法与分光光度法测定血塞通注射液溶血度对比图(20091128 41)

4 结论与讨论

实验结果表明，肉眼观察法可判定产生溶血的样品，用分光光度法测定其溶血度都在50%以上，红细胞计数法测定的溶血度在75%以上;对于肉眼观察法观察溶血不明显，结论不确定或者不溶血者，分光光度法测定溶血度在0%～50%，而细胞计数法则在0%～75%。这与文献[8，9]报道结果大致相同。但对于介于溶血不明显或不能确定的样品，不同人的观察判断结果不同。因此，肉眼观察法对结果的判断受主观影响的误差较大。

《中国药典》规定采用肉眼观察法对中药注射剂溶血进行观察。此法虽简便，省时，但适用于溶血现象明显的样品。由于其通过肉眼来观察，有时又受到注射剂本身颜色和部分血细胞破裂后释放出的血红素颜色的影响，主观误差对结果产生的影响较大。而《药物研究技术指导原则》[2]中对分光光度法测定溶血试验的参考指标明确指出，当溶血率＞5%时，表明有溶血发生，此时本实验中肉眼观察法结果却为阴性。因此肉眼观察法对中药注射剂溶血反应发生程度无法给予准确判断，需寻找出适宜的方法代替肉眼观察法。

结合《中国药典》与文献[6，7]，本实验最开始对部分影响溶血测定的因素进行了考察。为平行对照肉眼观察法与另外两种溶血检测方法，水浴温度参照《中国药典》规定，选取(37±0.5)℃。以阴性对照组和阳性对照组为试验管分别对保温时间为30，45，60，90，120，150 min进行了考察，结果表明，阴性对照组水浴150 min内不发生自然衰败，而阳性对照组在30 min内即产生全溶血，并且随时间的增加，其吸光度值不再改变。而实验过程中发现，加入一定量血塞通注射液的供试品随着水浴时间延长，其溶血度也逐渐增大。因此，选用120 min水浴时间，同文献[7]报道半小时水浴时间相比，其优势在于便于观察低剂量注射液溶血反应情况且样品用量少;降低由于人为操作时间差异而引起的误差;同时由于反应时间相对较长，更有利于观察血塞通注射液对红细胞混悬液的影响。本实验又对离心速度和时间进行了考察。选用离心时间为10 min，转速分别为1 000， 2 000， 3 000， 4 000 r·min-1，结果发现1 000，2 000 r·min-1仍可以观察到离心不完全的现象，3 000 r·min-1时10 min就可达到完全分离效果，4 000 r·min-1也可达到完全分离，但因转速较高，为避免离心速度过快而造成外力溶血，故选用离心速度为3 000 r·min-1，离心时间为10 min。因此确定实验条件为水浴温度(37±0.5)℃，水浴时间2 h，离心速度3 000 r·min-1，离心时间10 min。

红细胞计数法与肉眼观察法相比，不受主观误差的影响，但是实验操作繁琐，观察时间较长，在测定过程中红细胞易发生自身破裂，且对于滴于计数板上的样品内红细胞分布要求均匀，一旦不均匀则需重新测定，此过程又可造成一些血细胞破裂。此外，如表3、4所示，红细胞计数法的测定结果显示其RSD值均较大，表明其精密度差，会造成测量值不准确，因此对注射剂溶血的检测实用性较低。

分光光度法同其他两种方法相比，其优势在于实验操作简便，测量时间短，且能给出定量结论。即使注射剂颜色较深，也可用供试品对照溶液来校正，大大减小主观误差影响。表5、6结果显示，每组实验的RSD值均小于5%，故分光光度法的精密度好。测量结果值准确，误差较小。因此适用于检测中药注射剂溶血度。

如图3、4所示，红细胞计数法与分光光度法相比，两者对溶血度上升趋势的测定有一定的一致性，即随着血塞通注射液浓度的增加，两者的溶血度测量值也相应地增高。但红细胞计数法得到的溶血度通常大于分光光度法的结果，这可能由于采用红细胞计数法操作过程繁琐且耗时较长引起红细胞的破裂而造成溶血度偏高。因此采用分光光度法测定血塞通注射液的溶血度更简便、快捷、误差小，分光光度法更适合用于检测中药注射剂溶血反应。

[1]国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社，2010:附录92.

[2]国家食品药品监督管理局.药物研究技术指导原则(中药、天然药物刺激性和溶血性研究的技术指导原则)[M].北京:中国医药科技出版社，2005:230.

[3]章宝娟.中药注射剂溶血性试验方法的研究概述[J].海峡药学，2007，19(8):79-81.

[4]任国庆，牛海玲.血液病患者血清乳酸脱氢酶浓度变化的临床意义[J].现代中西医结合杂志，2010，19(1):100.

[5]匡海学.中药化学[S].北京:中国中医药出版社，2003:242.

[6]杨光，项峥，康廷国，等.人参皂苷溶血测定的实验条件研究[J].辽宁中医药大学学报，2008，10(6):190-191.

[7]程大任，付锐，窦德强，等.人参皂苷溶血及抗溶血作用研究[J].中国现代中药，2007，9(7):20.

[8]韩立伟，李锦莲.紫外分光光度法测定中草药注射液的溶血度[J].黑龙江医药科学，2003，26(4):84.

[9]周燕文，何淑华，莫武宁.中药注射剂溶血度测定的3种方法比较[J].中国中药杂志，2002，27(6):465-467.

Study on Detecting Methods of Haemolysis for Xuesaitong Injection

ZHANG Jian-feng，XIANG Zheng，DOU De-qiang
(College of Pharmacy Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian116600，China)

Objective:To find a better method for detecting the haemolysis of Traditional Chinese Medicine Injections.Methods:Apply macroscopic observation，cytometry and spectrophotometry to determine the haemolytic degree of Xuesaitong Injection.Results:The data given by different methods varied from each other.The results given by visual inspection，which showed little or unclear haemolysis phenomena，can be got in specific value by the other two methods.Meanwhile，cytometry and spectrophotometry have coherence in the uptrend of haemolysis.All the relative standard deviation(RSD)of different groups got from cytometry were more than 5%while spectrophotometry were less than 5%.Conclusion:Spectrophotometry is more convenient and suitable than the other two in inspection of haemolytic degree of TCM Injections.

Haemolysis;Adverse drug reaction;Spectrophotometry

高等学校博士学科点专项科研基金课题(20092133110001)，国家自然科学基金项目(30973859)，辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目(2008RC34)

*窦德强，E-mail:doudeqiang2003@yahoo.com.cn

2010-06-19)