多指标成分分析确定山茱萸最佳采收期△

陈随清，魏雅磊，王静，陈磊磊，李君

(河南中医学院，河南 郑州 450008)

质量标准

多指标成分分析确定山茱萸最佳采收期△

陈随清*，魏雅磊，王静，陈磊磊，李君

(河南中医学院，河南 郑州 450008)

目的:分析河南、浙江、陕西3个产区山茱萸中主要化学物质的积累规律，确定最佳采收期。方法分别对山茱萸样品中的熊果酸、马钱苷、鞣质、多糖、总有机酸的含量以及醇浸物、水浸物等指标进行测定，对测定结果进行主成分分析。结果3个产区不同生长期的山茱萸中主要化学物质积累都具有一定的规律;山茱萸果树生长年限对药材质量影响不大;果树的大小年现象对药材质量影响也不明显。结合当地的传统采收习惯，确定河南、浙江两产区最佳采收期为10月下旬，陕西产区为10月中旬。结论研究结果为山茱萸传统采收期提供了科学依据。

山茱萸;采收期;化学成分;主成分分析

山茱萸，又名山萸肉、萸肉、枣皮、药枣等，是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.除去果核的干燥成熟果肉，具有补益肝肾，收涩固脱的功能[1]，是临床常用中药。现代研究证明，山茱萸中含有多种成分，如有机酸类、环烯醚萜苷类、鞣质、多糖、氨基酸、维生素及矿质元素等，具有提高免疫力，降血糖，抗衰老等作用[2]，因此临床用量很大。

山茱萸主产于我国的河南、浙江、陕西等省，四川、安徽、山东亦有栽培。随着近几年来我国农村种植结构的调整，山茱萸的栽培面积正在逐渐扩大，目前以河南省栽培的产量最大，是河南省的道地药材。作为人工栽培的药材，山茱萸缺乏综合评价和分析药材质量的方法，采收期没有统一规范。在河南、浙江、陕西3个山茱萸主产区，主要采收山茱萸成熟果，每年9月底至10月中旬，是山茱萸的采摘期，但缺乏科学研究依据。作者曾对山茱萸果实1年内熊果酸、马钱苷的动态积累规律进行了研究，初步研究了1年内山茱萸果实中熊果酸、马钱苷含量变化的规律[3]。为了科学评价山茱萸药材的采收期，了解多年生木本果树生长年限以及大小年现象对药材质量的影响，我们采用熊果酸、马钱苷、总鞣质、总多糖、总有机酸，以及醇溶性浸出物、水溶性浸出物等指标，对1年内山茱萸果实中化学成分动态积累规律、不同生长年限和不同生长年份山茱萸果实中化学成分的含量变化进行了研究，报道如下。

1 材料、仪器及试剂

1.1 材料

山茱萸药材分别采自河南西峡、浙江临安、陕西佛坪，经河南中医学院陈随清教授鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。研究3个产区不同采收时间化学成分含量的变化关系时选用河南、浙江、陕西3个产区30～50年树龄的山茱萸，2007年8～10月采集山茱萸药材样品;研究3个产区不同生长年限山茱萸化学成分含量变化关系时，选用河南、浙江、陕西3个产区2008年10月采集的不同生长年限的山茱萸药材样品;研究3个产区连续3年山茱萸中化学成分含量的变化关系时，选用河南、浙江、陕西3个产区2007～2009年10月份采集的山茱萸药材样品。

1.2 仪器

RE-52A旋转薄膜蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SHZ-D型循环水式多用真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)，DHG-9053A型干燥箱(上海医用恒温设备仪器厂)，ZK-82A型真空干燥箱(上海市实验仪器总厂)，AGLIENT8455型紫外 -可见分光光度计，BS224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，岛津LC-20AT高效液相色谱仪(SPD-20A型紫外检测器，CTO-10ASVP型柱温箱，CBM-102型工作站)，KQ-500DV数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)，PHS-2C型pH计(上海大谱仪器有限公司)，磁力搅拌器;HH-S型恒温水浴锅(巩义市英峪予华仪器厂)。

1.3 试剂

熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110742-200516);马钱苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号:111640-200604);没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110831-200302)，干酪素(北京双旋微生物培养基制品厂)。甲醇、异丙醇、乙腈为色谱纯(天津四友精细化学品有限公司)，所用其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 马钱苷含量测定

采用《中国药典》2005版一部山茱萸项下含量测定方法，方法学考察结果符合要求，测定结果见表1、 3、 4。

2.2 熊果酸含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS(4.0 mm×250 mm，5μm)，流动相:乙腈-甲醇-水-磷酸(60∶15∶25∶0.1)， 流速:1 mL·min-1， 检测波长:213 nm，柱温:25℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 取熊果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品粗粉1 g，精密称定，置索氏提取器内，加乙醚适量，加热回流提取4 h，提取液回收乙醚至干，残渣加石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次15 mL(约浸泡2 min)，倾石油醚，残渣加甲醇微热使溶解，定量转移至5 mL容量瓶内，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

方法学考察该结果符合要求，测定结果见表1、3、 4。

2.3 多糖含量测定

称取山茱萸粉末0.1 g，加入50 mL 80%乙醇溶液，振荡3 h，取出后过滤。取滤渣吹干后加入50 mL蒸馏水，放置水浴锅中温浸1 h后过滤，取滤液15 mL用蒸馏水定容至50 mL。从中取2 mL置于10 mL的具塞试管中，加5%的苯酚溶液1 mL，摇匀，加浓硫酸5 mL，静置5 min，然后水浴加热15 min，取出冷却至室温，在484.4 nm处测定其吸光度。方法学考察该结果符合要求，测定结果见表1、3、4。

2.4 鞣质含量测定

采用《中国药典》2005版一部附录X鞣质含量测定法项下测定方法测定。方法学考察结果符合要求，测定结果见表1、3、4。

2.5 总有机酸含量的测定

采用《中国药典》2005版一部附录Ⅷ电位滴定法和永停滴定法项下电位滴定法测定，以酒石酸计，测定有机酸含量，方法学考察结果符合要求，测定结果见表1、3、4。

2.6 水溶性浸出物的测定

采用《中国药典》2005版附录X浸出物测定法项下水溶性浸出物测定法冷浸法测定，方法学考察结果符合要求，测定结果见表1、3、4。

2.7 醇溶性浸出物的测定

采用《中国药典》2005版附录X浸出物测定法项下醇溶性浸出物测定法测定，方法学考察结果符合要求，测定结果见表1、3、4。

3 结果

3.1 3个产区不同采收时间山茱萸药材各指标成分测定结果

见表1。

表1 3个产区不同采收时间山茱萸药材各指标成分测定结果/%

3.1.1 主成分分析测定 主成分分析是从多个数值变量之间的相互关系入手，利用降维的思想，将多个变量化为少数几个互不相关的综合变量，最大限度地保留原样本集所含的原始信息，使新变量成为原变量的线性组合，并寻求主成分来研究样本的一种方法[4]。 本文参考文献[5]运用 spss统计分析软件对测定结果进行主成分分析。由于各指标的量纲不同，在计算之前须先消除量纲的影响，所以需要将原始数据进行标准化。各指标数据标准化之后，对指标进行相关性分析，确定主成分个数及相关系数，然后就可以得出主成分表达式。本文中3个产地的药材都提取了1个主成分，所以3个产区主成分表达式如下:

3.1.2 不同采收时间样品综合分析得分 根据3.1.1的主成分方程表达式，分别计算3个产区的药材综合得分并排序，结果见表2。

表2 3个产区不同采收时间药材综合分析得分结果

可以看出河南和浙江产区药材得分最高者都在10月下旬，陕西产区药材得分最高在10中旬。

3.2 3个产区不同生长年限山茱萸药材化学成分含量的变化结果

见表3及图1～3。

表3 3个产区不同生长年限山茱萸药材中化学成分含量测定结果/%

图1 河南不同生长年限山茱萸药材中化学成分含量变化图

图2 陕西不同生长年限山茱萸药材中化学成分含量变化图

图3 浙江不同生长年限山茱萸药材中化学成分含量变化图

对3个主产区的数据进行综合比较，发现3个主产区内不同生长年限山茱萸药材的马钱苷、水溶性浸出物的含量都符合《中国药典》2005版规定，因此，生长年限对山茱萸药材的质量影响不大，均可采收。陕西、河南的山茱萸药材各指标成分在30～50年有一个低谷;浙江山茱萸药材的各成分在20～30年有一个低谷。初步分析，山茱萸在20～50年为盛果期，但是各指标成分的含量都在低谷，可能与植物生长在旺盛时期，座果率较高，果实积累的有效成分较少有关。

3.3 3个产区2007～2009年同期山茱萸中化学成分含量的变化结果

见表4， 图4～6。

图4 河南2007～2009年山茱萸药材中化学成分含量变化图

表4 3个产区2007～2009年山茱萸中化学成分含量测定结果/%

图5 陕西2007～2009年山茱萸药材中化学成分含量变化图

图6 浙江2007～2009年山茱萸药材中化学成分含量变化图

参考表4及图4～6，3个产区2007～2009年连续3年山茱萸药材各化学成分含量没有明显差异。现在山茱萸果树多为人工种植，或野生人工抚育，药农主动施肥、锄草、农药防治病虫害等情况比较普遍，山茱萸果树产量自然的大小年现象已不明显。

4 讨论

4.1 主成分分析法确定最佳采收期

通过对河南、陕西、浙江3个主产区山茱萸7类化学物质进行主成分分析，发现3个产区的山茱萸药材第一个特征因子皆为总有机酸，对确定1年内最佳采收期的贡献度最大，分别为96.0%(河南)，83.1%(陕西)，95.77%(浙江)。从表2可以看出，河南、浙江产区最佳采收期为10月下旬，陕西产区为10月中旬。本次实验包含了山茱萸中7种化学物质的最佳综合信息，分析结果与山茱萸产区的实际生产情况和传统经验也是一致的。山茱萸为成熟果肉入药，传统习惯为成熟果实除去果核后的果肉干燥入药。从各种化学物质含量测定结果可以看出，不同化学物质在果实从青果到成熟过程中积累规律是不一样的，有的趋于上升，有的下降，单一成分分析山茱萸的采收期是很困难的，本文采用主成分分析方法提取出7种化学物质的综合信息，得到最佳结果，为山茱萸的传统采收期提供了科学依据。从地理分布看，陕西产区与河南、浙江产区相比，分布海拔更高，山茱萸成熟期也稍早，每年9月中旬至10月中旬山茱萸进入成熟期，传统上10月下旬山茱萸采收结束;浙江、河南产区每年9月下旬山茱萸进入成熟期，传统上10月底采收结束。

4.2 生长年限对药材质量的影响

山茱萸作为多年生木本植物，其生长年限是否对药材质量产生影响，目前研究的尚少，从研究结果看，山茱萸生长年限对药材质量没有明显影响。但是我们也发现，有些木本药用植物随着生长年限延长，可见植株老化、死亡现象，如连翘、桃树、杏树等，果实的产量也会明显降低，至于药材的质量没有见研究报道，有待进一步研究。

4.3 植物结果 “大小年”现象对药材质量的影响

多年生木本植物，在自然生长条件下，果实的产量会有大小年之分，这是由于植物结果量较大，对植物本身和周围环境消耗养分也较多，第2年植物营养成分减少，结果量降低，形成小年，如山茱萸、五味子、木瓜、栀子、连翘、桃、杏等都存在这种现象。植物结果 “大小年”现象对药材质量是否有影响，目前也未见有研究报道。从山茱萸研究情况分析，这种情况研究起来比较复杂。因为，一是植物结果受自然气候影响较大，自然气候适宜或形成灾害会导致 “大小年”;二是很多药用植物目前为人工栽培或人工抚育，人工浇水、施肥等干预措施会使植物结果 “大小年”现象不明显。所以，结合实际情况对野生药材结果 “大小年”的检测，对药材质量影响的研究才有意义。

总之，对于以果实、种子入药的多年生木本植物而言，采收期的研究要比草本植物研究更复杂，建议加强这方面的研究，为中药材的规范化种植、资源的开发利用和保护提供科学依据。

[1]国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社，2010:26.

[2]杨剑芳，路福平，高文远，等.山茱萸的化学、药理及开发应用研究进展[J].现代生物医学进展，2006，(12):127-131.

[3]陈随清，杨晋，王利丽，等.山茱萸果实成熟前后熊果酸和马钱素的含量变化[J].中国现代应用药学，2005，(1):38-39.

[4]于秀林，任雪松.多元统计分析[M].北京:中国统计出版社，1998:154-169.

[5]张文霖.主成分分析在SPSS中的操作应用[J].市场研究，2005(12):31-34.

Determine the Optimal Collection Time of Corni Fructus by the Analysis of M any Target Components

CHEN Sui-qing， WEI Ya-lei， WANG Jing， CHEN Lei-lei， LIJun
(Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou450008，China)

Objective:To analysis accumulation rule of major chemical substances of Corni Fructus in three production areas of Henan，Zhejiang and Shanxi to determine the best harvest time.

Methods:Determining and analysing the content of ursolic acid， loganin， tannin， polysaccharide，total organic acids，water-soluble extract and ethanol-soluble extract of Corni Fructus samples.Results:There is a certain accumulation rule of major chemical substances of Corni Fructus in different growth period from three production areas.The growth age of Corni Fructus has little effect on the quality of medicines;good harvest or yield reduction of Corni Fructus has not obvious influence on the quality of medicines，too.Considering the local harvest habits traditionally，it approved that the best harvest period of Henan and Zhejiang is in late October and the best harvest of Shanxi is the mid of October.Conclusion:This result provides a scientific basis for the traditional harvest period of Corni Fructus.

Corni Fructus;Harvest period;Chemical composition;Principal component analysis

国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAI09B05-8，2006BAI06A15-3)

*陈随清，Tel:(0371)65676686，E-mail:suiqingchen@sohu.com

2010-10-13)