雷氏珍菊降压片的HPLC指纹图谱研究△

徐晓英，唐宇伟，黄德杰，张国明

（上海市中药研究所，上海 201401）

雷氏珍菊降压片的HPLC指纹图谱研究△

徐晓英，唐宇伟，黄德杰，张国明*

（上海市中药研究所，上海 201401）

目的：探索建立雷氏珍菊降压片的指纹图谱质量控制方法。方法：采用RP-HPLC梯度洗脱法测定珍菊降压片的指纹图谱，并运用国家药典委员会发布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件分析比较其相似度。结果：初步建立了含有10个特征峰的雷氏珍菊降压片高效液相指纹图谱，并归属了其中的盐酸可乐定、氢氯噻嗪、芦丁和蒙花苷峰；14批样品相似度系数均大于0.989。结论：RP-HPLC（DAD）法指纹图谱特征性较强、重复性好，可用于珍菊降压片的质量控制。

雷氏珍菊降压片；指纹图谱；RP-HPLC

雷氏珍菊降压片是一种中西药复方制剂，为中老年人常用降血压药物之一。该制剂质量标准收载于卫生部部颁标准[1]，由野菊花、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、芦丁、珍珠层粉等成分组成。标准中只有珍珠层粉和芦丁的定性鉴别，无含量测定项，难以客观、全面、有效地控制其质量。近年来有不少文献报道采用高效液相法测定珍菊降压片中的蒙花苷[2]、绿原酸[3]、氢氯噻 嗪和芦 丁[4]、盐 酸 可乐定[5-6]的含量，但未见相关的指纹图谱研究报道。为更好地控制珍菊降压片的产品质量，本文探索了以HPLC指纹图谱技术为手段的质量控制方法，以期更有效控制该产品的一致性、重现性。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪，G1354A HPLC四元泵，Agilent DAD-G1315A紫外检测器，Agilent-UP-G1316柱温箱，Agilent G1312A真空在线脱气机，HPCHEM-STATION色谱工作站。《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A、B版》。

1.2 试药

蒙花苷（111528-200303）、盐酸可乐定（111528-200303）、氢氯噻嗪 （10309-001）、芦丁 （0080-9705），均购自中国药品生物制品检定所。乙腈为色谱纯，水为超纯水（实验室自制），其他试剂为分析纯。

野菊花浸膏样品、雷氏珍菊降压片由上海雷允上药业有限公司提供。

浸 膏 批 号 （3 批）：20040107，20040503，20040701，拟用于建立浸膏对照指纹图谱样品；成品样品（8批）：20010204，20011105h，20020212h，20030510， 20040121， 20040318， 20040707，20040807，拟用于建立成品对照指纹图谱样品；成品样品（12批）：20020123，20020127，20020129，20020213， 2002120860， 20040101， 20040104，20040120， 20040123， 20040202， 20040227，20040303，20040326，20040713，拟用于与对照图谱作比较的被测样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18柱；流动相：乙腈（A）和0.03 mol·L－1磷酸二氢钾溶液（B）梯度洗脱，梯度条件见表1；检测波长：210 nm；柱温：35℃；流速：1.0 mL·min－1；进样量：10μL；分析时间：60 min。

表1 流动相梯度条件

2.2 对照品溶液的制备

精密称取蒙花苷、盐酸可乐定、氢氯噻嗪、芦丁对照品适量，配制成混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取珍菊降压片10片，剥去包衣，研细混匀，取本品粉末0.25 g，精密称定，置100 mL具塞三角烧瓶内，准确加入50 mL 10%甲醇，称定重量，置超声波发生器中超声处理30 min，放冷，再称定重量，用10%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适应性试验 以上述色谱条件下的混合对照品溶液进样试验，盐酸可乐定、氢氯噻嗪、芦丁和蒙花苷的色谱峰理论板数均大于1 500；盐酸可乐定和氢氯噻嗪二峰间分离度1.4，氢氯噻嗪和芦丁、芦丁和蒙花苷二峰间分离度均远大于1.5。

2.4.2 稳定性试验 取样品（批号20040120），按2.3项方法处理，于0，2，4，6，8，12，24 h进样进行HPLC分析。结果所测的蒙花苷、盐酸可乐定、氢氯噻嗪和芦丁成分保留时间和保留峰面积RSD（%）分别是0.58和1.65、0.89和1.85、0.87和1.81、0.89和1.63，均小于2.0%。

2.4.3 精密度试验 精密称取样品（批号20040120），按2.3项方法处理，连续进样5次，以蒙花苷、盐酸可乐定、氢氯噻嗪和芦丁成分为指标，进行HPLC分析，结果所测4个峰保留时间和峰面积RSD（%）分别是0.76和1.14、1.08和1.35、0.95和1.61、0.69和1.73，均小于2.0%。

2.4.4 重复性试验 精密称取样品（批号20040707）5份，分别按2.3项方法处理，分别进样分析，结果所测的蒙花苷、盐酸可乐定、氢氯噻嗪和芦丁成分保留时间和峰面积RSD（%）分别是0.87和1.08、1.39和1.81、1.27和1.74、1.32和1.67，均小于2.0%。

2.5 指纹图谱的测定及结果

分别取各批次珍菊降压片，按2.3项方法处理获得供试品溶液，进样10μL，记录HPLC色谱图，结果见图1，主要有10个峰，其中4号峰为盐酸可乐定，5号峰为氢氯噻嗪，6号峰为芦丁，10号峰为蒙花苷，其余6个成分主要来自于野菊花。对照用样品（8批）共有峰相对保留时间和相对峰面积见表2和表3。待检验比较样品（14批）共有峰相对保留时间和相对峰面积见表4和表5。

图1 珍菊降压片指纹图谱（批号20040120）

表2 对照用（8批）珍菊降压片相对保留时间

2.6 相似度分析

进入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统-A》，导入8批对照指纹图谱样品的AIA文件，以各峰作多点校正，生成对照指纹图谱，结果见表6。结果显示，8批间内的相似度均在0.985以上，说明该药在较长时间跨度内，其重现性较佳。图2为欲生成对照谱图的成品样品（8批）指纹谱图比较，图中R表示对照谱图。

表3 对照用（8批）珍菊降压片相对峰面积

表4 待检验（14批）样品相对保留时间

表5 待检验（14批）样品相对峰面积

表6 对照样品（8批）指纹图谱相似度分析结果

图2 欲生成对照谱图的成品样品（8批）的指纹谱图

2.7 珍菊降压片指纹图谱检验

进入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统-B版》，先导入上述已生成的珍菊降压片对照图谱文件，再导入14批待检验样品的AIA文件，选定10个共有峰进行谱峰匹配，进行相似度比较，结果相似度评价数据均高于0.989，表明该产品一致性程度较高。

3 讨论

本文以HPLC图谱的出峰灵敏度和分离完整性为标准，对样品提取用溶媒进行了筛选，结果以10%甲醇溶液提取，效果较好。在提取方法上，对超声提取与回流提取方法作了平行比较，结果显示10%甲醇超声30 min的提取方法与加热回流3 h的效果相当，最后选用10%甲醇超声30 min的提取方法。

在流动相选择上，筛选了乙腈与多种浓度磷酸、醋酸、柠檬酸以及磷酸二氢钠、钾等溶液组合，结果以乙腈-0.03 mol·L－1磷酸二氢钾溶液组合的梯度洗脱效果最佳。

珍菊降压片是中西复方制剂，在检测波长选择方面，需要关注主要有效成分（盐酸可乐定、芦丁、氢氯噻嗪、蒙花苷λmax分别为198.40，205.40，226.00，206.80 nm），但也要兼顾其他各成分甚至包括未知的峰，为此经筛选试验，确定检测波长210 nm比较适合。

在共有峰认定上，通过对不同期的多批供试品指纹图谱分析，选择了10个稳定性好、特征明显的色谱峰为共有峰，并归属了其中的4（盐酸可乐定）、5（氢氯噻嗪）、6（芦丁）和10（蒙花苷）号峰，其余6个峰来自野菊花或芦丁提取物。

本文以多批具有代表性的大生产样品为基础，采用国家药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件，建立了珍菊降压片的数字化对照指纹图谱，同时以此为对照，检验了14批雷氏珍菊降压片样品相似度情况，结果相似度系数大于0.989；另外其各批指纹图谱间的保留时间和峰面积的相对误差也分别小于3.01%和4.19%。

上述实验结果表明，高效液相指纹图谱技术评判雷氏珍菊降压片的相似性具有比较强的客观性，重现性良好，可以作为企业内部质量控制或原法定标准的提高之参考。

[1]卫生部.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂[S].第20册.1998：232.

[2]张国明，华菊根，邓海林.一种珍菊降压片的质量控制方法：中国，ZL200410016223.3[P].2005-08-17.

[3]郁健，叶晓镭.HPLC法测定珍菊降压片中绿原酸的含量[J].南京中医药大学学报，2004，20（4）：237.

[4]闰花丽，吉曙光，黄安军.HPLC测定珍菊降压片中氢氯噻嗪和芦丁的含量[J].中成药，2004，26（7）：547.

[5]郁健，叶晓镭.高效液相色谱法测定珍菊降压片中盐酸可乐定的含量[J].中国药物与临床，2004，4（9）：715.

[6]杨继斌，汤晓枢.HPLC法测定珍菊降压片中盐酸可乐定的含量[J].药物分析杂志，2006，26（12）：1854.

Establishment of the Fingerprint of Leishi Brand Zhenju Jiangya Tablet by HPLC

XU Xiao-ying，TANG Yu-wei，HUANG De-jie，ZHANG Guo-ming
（Shanghai Institute of traditional Chinese Medicine，Shanghai201401，China）

Objective：To establish the fingerprint of Leishi Brand Zhenju Jiangya Tablet.Methods：A fingerprinting of Leishi Brand Zhenju Jiangya Tabletwas invested by RP-HPLC with a gradient elution mode.，the simalarity was analysed by Fingerprint Similarity Evaluation Software.Results：The fingerprintingwith 10 characteristic peaks，among ofwhich peak 4，5，6 and 10 identified as Clonidine hydrochloride，Hydrochlorothiazide，Rutin and Linarin.The similarity of 14 samples are all higher than 0.989.Conclusion：The fingerprintmethod established show to be easy，repeatable and sensitive to distinguish the samples tested.

Leishi Brand Zhenju Jiangya Tablet；Fingerprinting；HPLC

上海市技术创新体系建设项目[上海市经委2004（沪创新J-7）]

*张国明，Tel：（021）37565589，E-mail：zhangguoming1271＠yahoo.com.cn

2011-06-20）