20（R）-原人参二醇酸水解条件的工艺研究△

杨雅淇，郑新涛，赵余庆，3*

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；3.基于靶点的药物设计与研究重点实验室，辽宁 沈阳 110016）

工艺

20（R）-原人参二醇酸水解条件的工艺研究△

杨雅淇1，郑新涛2，赵余庆2，3*

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；3.基于靶点的药物设计与研究重点实验室，辽宁 沈阳 110016）

目的：优化三七茎叶总皂苷的盐酸水解工艺，提高水解产物20（R）-原人参二醇 [20（R）-protopanaxadiol，20（R）-PPD]的产率。方法：采用正交试验设计，考察料液比、盐酸浓度、水解时间、水解温度对三七茎叶总皂苷水解过程的影响。结果：影响水解的主次因素依次是盐酸浓度＞料液比＞水解温度＞水解时间，优选的最佳工艺为料液比1∶1；盐酸浓度17.1 mol·L－1，水解时间90 min，水解温度50℃。结论：采用优化后的水解条件能够提高PPD的转化率，适合工业化生产。

三七茎叶总皂苷；盐酸水解；PPD

三七为五加科植物三七Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根，具有散瘀止血，消肿定痛的功能。三七中含有多种类型的成分，人参皂苷为三七的主要有效成分之一。现代药理研究表明，三七皂苷可通过直接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长或转移、诱导肿瘤细胞凋亡或诱导肿瘤细胞分化使其逆转、增强和刺激机体免疫功能等多种方式起到抗肿瘤作用[1]。正因为三七具有如此显著的生理活性，近年来成为人们研究的热点。

研究表明，三七中含有与人参相同或相似的成分。本课题组已有报道从三七茎叶水解产物中分离得到人参二醇（PD），人参三醇（PT），（20R，25S）β，25-epoxy-20，25-cyclodammaran-3β，6α-diol，达玛烷-20（22）-烯-3β，12β，25-三醇和 20（R）-达玛烷-3β，12β，20，25-四醇[2-4]。另有文献报道，以三七茎叶总皂苷为原料经碱水解和酸水解过程分别得到20（S）-原人参二醇和20（R）-原人参二醇（PPD）[5]等20多种活性成分，其中PPD具有较强的抑制癌细胞增长的作用，其诱导细胞凋亡的活性优于已经成功开发为一类新药的人参皂苷Rg3[6]，PPD化学结构见图1。

图1 20（R）-原人参二醇

同时本课题组已报道从三七茎叶水解产物中分得的20（R）-25-OH-PPD和25-OCH3-PPD具有显著的抗癌活性[7]，它们都与 PPD的结构很相似，所以，如果能够大量制备PPD，以此为先导化合物进一步结构修饰，制备和寻求活性更强的抗肿瘤化合物，对发现新的活性成分或半合成原料，扩大药用资源及进行创新药物的开发研究将具有十分重要的意义。

1 材料

1.1 材料

三七茎叶总皂苷（广西昌洲天然药物有限公司）；PPD对照品（含量98%）；盐酸（分析纯）；纯净水。

1.2 仪器

KNAUER高效液相分析色谱仪（德国 KNAUER），Unimicro Technologies蒸发光散射检测器（上海通微科技有限公司），Kromasil ODS色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm，北京创新科技有限公司），HX502电子天平（慈溪市天东衡器厂），KQ3200DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），DK-98-1电热恒温水浴锅（天津力泰斯仪器有限公司），RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪厂），JC202型电热恒温干燥箱（上海成顺仪器仪表有限公司）。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇-水（0～25 min，87∶13；25～60min，95∶5）。流速：1.0 mL·min－1，柱温：25℃，检测器漂移管温度：40℃，压力：2.5×105Pa。进样量：10μL。

2.2 对照品和供试溶液的配制

称取干燥至恒重的皂苷元PPD适量，加甲醇制成浓度为 15 mg·mL－1对照品溶液。对照品溶液HPLC图见图2。

图2 PPD对照品HPLC图

取水解产物样品适量，精密称定，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）滤过，得浓度为 10 mg·mL－1的供试品溶液。

2.3 三七茎叶总皂苷盐酸水解单因素试验

2.3.1 不同浓度盐酸对三七茎叶总皂苷水解的影响分别称取1 g三七茎叶总皂苷，共5份，分别加入浓度为 2.87，6，7.7，9.45，17.1 mol·L－1的盐酸1 mL，55℃水解1.5 h，水解产物经液相检测，计算三七茎叶总皂苷水解产物中PPD含量。

2.3.2 不同温度对三七茎叶总皂苷水解的影响 分别称取1 g三七茎叶总皂苷，共5份，加入1 mL 17.1 mol·L－1的盐酸，分别在 45，50，55，60，65℃水解1.5 h，水解产物经液相检测，计算三七茎叶总皂苷水解产物中PPD含量。

2.3.3 不同水解时间对三七茎叶总皂苷水解的影响分别称取1 g三七茎叶总皂苷，共5份，加入1 mL 17.1 mol·L－1的盐酸，在 55℃分别水解 30，40，50，60，90 min，水解产物经液相检测，计算三七茎叶总皂苷水解产物中PPD含量。

2.3.4 不同料液比对三七茎叶总皂苷水解的影响分别称取1 g三七茎叶总皂苷，共5份，分别加入浓度为 17.1 mol·L－1的盐酸0.8，1，1.5，2，2.5 mL，在55℃水解1.5 h，水解产物经液相检测，计算三七茎叶总皂苷水解产物中总PPD含量。

2.4 三七茎叶总皂苷盐酸水解正交试验

根据单因素得出的最佳提取条件，设计4因素3水平正交试验，并进行极差分析和方差分析。

3 结果与分析

3.1 三七茎叶总皂苷盐酸水解单因素试验结果

3.1.1 盐酸浓度对三七茎叶总皂苷水解产物中PPD含量的影响 图3反映了不同盐酸浓度对三七茎叶总皂苷水解产物中PPD含量的影响，可以看出，不同的盐酸浓度对三七茎叶总皂苷水解的影响很明显，当盐酸浓度为17.1 mol·L－1时PPD达到最高值，说明PPD在一定的酸度下才能得到较彻底的水解。

图3 不同盐酸浓度对三七茎叶总皂苷水解产物中PPD含量的影响

3.1.2 温度对三七茎叶总皂苷水解的影响 图4反映了不同温度对三七茎叶总皂苷水解的影响，可以看出，当温度由50℃时，PPD情况达到最好，之后随着温度的升高量呈现下降趋势。

图4 不同水解温度对三七茎叶总皂苷水解产物中PPD含量的影响

3.1.3 水解时间对三七茎叶总皂苷水解的影响 图5反映了不同水解时间对三七茎叶总皂苷水解的影响，可以看出，90 min时水解情况达到最好，之后随着时间的延长，PPD含量变化幅度趋于平缓。其原因可能是水解基本完全。

3.1.4 料液比对三七茎叶总皂苷水解的影响 图6反映了不同料液比对三七茎叶总皂苷水解的影响，当料液比为1倍时，PPD情况达到最好，之后随着料液比的升高量呈现下降趋势。

图5 不同水解时间对三七茎叶总皂苷水解产物中PPD含量的影响

图6 不同料液比对三七茎叶总皂苷水解产物中PPD含量的影响

3.2 三七总皂苷的盐酸水解的因素水平表

根据单因素实验考察结果，设计以酸浓度（浓盐酸）、水解温度、超声时间、料液比4个因素3水平的L9（34）正交试验，结果见表1、2。

表1 三七总皂苷酸水解L9（34）正交试验

表2 方差结果分析

从结果可以看出，影响PPD含量高低的因素依次为盐酸浓度＞料液比＞水解温度＞水解时间。在反应时间、反应温度和料液比一致的情况下，A3水平PPD得率最高；在盐酸浓度、反应时间和料液比一致的情况下，B1水平效果最好；盐酸浓度、反应温度和料液比一样的前提下C3水平的效果最佳；在盐酸浓度、反应温度和反应时间相同的前提下D2水平效果最好。因此，最终选定A3B1C3D2为三七总皂苷酸水解的最佳工艺，HPLC色谱图见图7。

图7 PPD最佳工艺HPLC图

4 讨论

三七总皂苷是一类活性很好的化合物，具有广泛的生理活性。这些化合物都是通过运用传统经典的植化手段和现代色谱技术获得，其单体皂苷的制备过程通常经过提取、萃取、柱层析等步骤，整个过程显得比较漫长、繁琐。目前，有关三七总皂苷及其单体皂苷的研究多集中于提取纯化工艺和含量测定方面，水解作为一种获得三七皂苷单体的手段对其研究还比较少。

三七皂苷的抗肿瘤活性已经得到证实，而PPD的结构与这些活性单体皂苷相似。因此，可以将其作为研究三七皂苷构效关系的先导化合物，进行一定程度上的结构修饰，开发成为抗癌活性更强的新药，具有潜在的开发和研究价值。

本文在充分积累本课题组前期大量有关三七皂苷及其水解研究的基础上，首次对三七总皂苷酸水解产物PPD的水解工艺进行了研究，运用单因素考察和正交设计试验得出了PPD的最佳水解工艺：料液比1∶1；盐酸浓度17.1 mol·L－1，水解时间 90 min，水解温度50℃。此条件下PPD的产率最高可达9.7%，非常适合工业化生产。

[1]孙小玲.三七的研究进展[J].云南中医中药杂志，2005，26（6）：44-46.

[2]Wei JX，Chang LY，Wang JF，et al.Zwei neue Dammaran-Sapogenine aus den Blattern vonPanax notoginseng[J].Plant Med，1982，45：1672-1711.

[3]胡晗绯，韩凌，赵余庆.三七茎叶皂苷水解产物中稀有抗肿瘤成分的化学研究[J].中国现代中药，2008，10（4）：6-8.

[4]赵余庆，袁昌鲁，傅玉琴，等.人参茎叶中微量三萜化合物的化学研究[J].药学学报，1990，25（4）：297-301.

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[6]Wang W，Zhao Y，Rayburn E，et al.In vitro anti-cancer activity and structure-activity relationshi Ps of natural Products i-solated from fruits of Panaxginseng[J].Cancer Chem pharm，2007，59（5）：589-601.

[7]Y，Zhao，W，Wang，L Han.Isolation，Structural Determination，and Evaluation of the Biological Activity of 20（S）-25-methoxyl-dammarane-3β，12β，20-triol[20（S）-25-OCH3-PPD]，a Novel Natural Product fromPanax notoginseng[J].Medicinal Chemistry，2007，3（1）：51-60.

Study on the Technology of Hydrolysis Process of 20（R）-PPD w ith Hydrochloric Acid

YANG Ya-qi1，ZHENG Xin-tao2，ZHAO Yu-qing2，3
（1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110032，China；2.ShenyangPharmaceutical University，Shenyang110016，China；3.KeyLaboratoryofStructure-BasedDrugDesign＆DiscoveryofMinistry ofEducation，ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China）

Objective：To optimize the hydrolysis technology of total saponins inPanaxnotoginsengwith hydrochloric acid in order to increase the yield of 20（R）-PPD.Methods：Orthogonal design was used to optimize the hydrolysis condition and four factors including solid/liquid ratio，concentration，reaction time and reaction temperature were investigated to study the process of hydrolysis.Results：The primary and secondary influence factors of this processwere listed as follows：concentration＞solid/liquid ratio＞temperature＞time and the optimization technology of hydrolysis process obtained was：the ratio of liquid to solid material at1∶1，the concentration of hydrochloric acid with 17.1 mol·L－1，and the reaction time and temperaturewere 1.5 h and 50℃ respectively.Conclusion：The yield of20（R）-PPD under the optimum hydrolysis condition was raised and this technology can be used for industrialization production.

Total panax notoginseng saponins；Hydrolysis；PPD

辽宁省天然产物现代分离与工业化制备工程技术中心（2008402021）

*赵余庆，Tel：（027）23986521 E-mail：zyq4885＠126.com

2011-04-06）