利用RT-PCR对病料中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测

许瑞利 梁俊昌 朱瑞良



利用RT-PCR对病料中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测

许瑞利①②梁俊昌②朱瑞良①

（①山东农业大学动物科技学院 泰安 271018 ②山东省枣庄市市中区畜牧兽医局）

本试验对枣庄市中区6个乡镇及周边地区的54个不同规模猪场及散户所采集的172份临床疑似“猪高热病”样品进行了检测，结果发现，枣庄地区检出高致病性PRRSV阳性占56.4%(97/172)，CSFV阳性占31.4%(54/172)。PRRSV和CSFV的混合感染占12.2%(21/172)，说明枣庄地区大部分猪场已经普遍存在PRRSV感染。

PRRSV 多重 RT-PCR CSFV 感染

近年来，随着枣庄地区生猪养殖量的不断增加，猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory synduome, PRRS)发生的越来越频繁，危害也越来越严重。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 发病猪病料采集时间为2008~2010年，采集枣庄市畜牧兽医局兽医实验室化验门诊病历，分别来自枣庄市中区6个乡镇及周边地区的54个不同规模猪场及农村散养户“疑似猪高热病”病猪或血样，共172份病料，包括病猪心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、胎儿组织、胎盘等脏器或血液样品。每一病例取部分病变组织3.0g左右，加少量灭菌PBS，用灭菌研磨器研磨至糊状，再加灭菌PBS释成乳剂，置-70℃冰箱反复冻融3次(血清样品无需研磨反复冻融)，3000~4000rpm，4℃离心5min，取上清置-20℃冰箱保存。

1.1.2 主要试剂 TRIzol®Reagent 购自Invitrogen 公司，One Step RNA RT-PCR试剂盒(AMV)为宝生物工程(大连)有限公司产品；DL2000 Marker，购自济南辰飞生物工程公司；其他化学试剂如氯仿、异丙醇、无水乙醇等，均为国产分析纯产品。

1.1.3 主要仪器 ELX800型酶标仪(美国BioTek公司)，TGL-16G型常温离心机(上海安亭科学仪器厂制造)，PCR仪、Centrifuge 5417R台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，JA1003型电子天平(上海精科天平)，DYYⅢ-31A/31B型电泳槽(北京六一仪器厂)，Gdldoc EQ凝胶成像分析系统(美国BIO-RAD公司)，SUB28型恒温水浴水槽(英国Grant公司)，超净工作台(加拿大Canadian Cabinets公司)。

1.1.4 引物 根据GeneBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1毒株，设计合成目的基因PRRSV Nsp2基因片段引物PN1、PN2和扩增ORF5基因的引物P51、P52，同时根据已发表的CSFV核酸序列，选择高度保守性5′端非编码区设计猪瘟引物C51、C52，引物由上海生工生物工程公司合成，使用前用灭菌超纯水配成浓度为25μmol/L，-20℃保存备用。经试验验证PN1、PN2、C51、C52 可以组合为多重RT-PCR同时检测高致病性PRRSV与CSFV(见表1)。

表1 引物设计 （bp）

1.1.5 RT-PCR相关溶液配制 按常规方法配制。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 用Trizol试剂盒提取病毒总RNA，操作方法按说明书进行。

1.2.2 一步法RT-PCR扩增 以病毒RNA核酸为模板进行RT-PCR扩增。反应体系为25μl。扩增程序为50℃反转录30min，94℃预变性2 min，然后进行30个循环(94℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1min)，最后72℃延伸10min，4℃保存。取10µl产物在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，观察。

1.2.3 特异性试验 分别取实验室保存的PRRSV SX-1变异毒株与CSFV疫苗毒株作为阳性对照，使用表1中4对引物混合物，分别对阳性对照和阴性对照进行扩增试验，测试引物特异性。

1.2.4 敏感性试验 核酸蛋白检测仪测定PRRSV SX-1株和CSFV疫苗毒株的混合RNA以确定其基因组RNA的浓度，并将提取的RNA依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取3μl作为模板，进行多重RT-PCR扩增以检测其敏感性。

1.2.5 临床病料的多重RT-PCR检测 利用建立的多重RT-PCR方法对枣庄地区的不同规模猪场及农村散养户“疑似猪高热病”病猪或血样进行检测，同时以PRRSV SX-1株和CSFV疫苗株为阳性对照，以灭菌水作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 特异性试验

分别提取PRRSV SX-1变异毒株与CSFV疫苗毒株，利用表1中4对引物的混合物，对上述模板进行扩增。结果在PRRSV的模板中，只扩增出了大小约为719bp的特异性片段；在含有CSFV的模板中，只扩增出了大小约为267bp的特异性片段。同时对临床“疑似高热病料”进行检测，结果见图1，反应特异性良好。

图1 引物特异性分析

1:DNA 分子质量标准；2:PRRSV阳性对照；3:CSFV阳性对照；4:永安病料；5:齐村病料

2.2 敏感性试验

用核酸蛋白检测仪测定得到PRRSV SX-1株与CSFV疫苗毒株的混合基因组RNA浓度为20 μg/ml。将提取的RNA依次做10倍梯度稀释，每个稀释度取10μl模板，用引物P1和P2进行RT-PCR扩增，结果显示其敏感性为20pg。

图2 7份临床病料的多重RT-PCR检测结果

1:税郭病料；2:西王庄病料；3 :DL2000 DNA Marker；4:齐村病料；5:孟庄病料；6:永安病料；7:光明病料8:其他病料；9:阳性对照；10:阴性对照

2.3 多重RT-PCR检测病料

RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳可见两条特异性扩增片段的条带，大小分别为750bp和260bp左右，与预期结果一致。多重RT-PCR 方法检测部分样品的电泳结果如图2所示。

表2 枣庄地区病料多重RT-PCR检测结果(2008~2010年)

从表2结果显示，2008~2010年间枣庄地区采集的172份疑似“猪高热病”样品高致病性PRRSV阳性占56.4% (97/172)，CSFV阳性占31.4%(54/172)。PRRSV和CSFV的多重混合感染，阳性占12.2%(21/172)。

3 讨论

2006年6月份以来，我国部分地区发生了“猪高热病”疫情，给养猪业造成了巨大的经济损失。其中高致病性PRRSV是导致猪“高热综合症”的主要病原之一，有些病例检测到CSFV。目前，很多猪场存在这两种传染病，并且CSFV和PRRSV常呈混合感染。本研究发现，枣庄地区PRRSV变异株阳性病料或猪瘟阳性病料，说明混合感染已十分普遍和严重，应当引起养殖场和管理部门的高度重视。枣庄地区采集的172份临床疑似“猪高热病”样品，高致病性PRRSV阳性占56.4%(97/172)，CSFV阳性占31.4% (54/172)。这与王仕荣等在广西“猪高热综合征”主要病原调查中，检出率最高的为PRRSV 变异株毒株占59. 59 %(87/ 146)相似，与李维华(2008)等报道的CSFV感染的阳性率较低，仅为3.13%不完全一致。王义桂等(2007)曾报道近几年山东省养猪业存在CSFV和高致病性PRRSV及PRV等多种病毒的混合感染。本试验对采集的172份样品进行了多重RT-PCR检测，结果表明，枣庄地区也均存在PRRSV和CSFV的多重混合感染，阳性占12.2%(21/172)，本试验进一步验证枣庄地区猪群中混合感染现象比较普遍。由于PRRSV能引起免疫抑制，促进CSFV等病毒的感染，造成细菌大量继发感染，可能加重猪发病并导致死亡。因此，在今后的疾病防控中，如何提高猪体的免疫力值得重视。此外，对2009年采集样品与1010年采集样品的检测结果进行数据统计时发现，2009年PRRSV阳性为50.0%(31/62)，CSFV阳性为24.2%(15/62)，而2010年PRRSV阳性率高达64.3%(63/98)，CSFV阳性率达到36.7%(36/98)，与近年来防疫力度有一定关系。

（2011–03–23）

S858.28

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1007-1733(2011)04-0011-02