低酰基结冷胶提取工艺研究

梁 涛，徐晓琴，黄 金，蔡 谨，徐志南

（浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州310027）

低酰基结冷胶提取工艺研究

梁 涛，徐晓琴，黄 金，蔡 谨，徐志南*

（浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州310027）

目的：针对高粘度结冷胶发酵液，发展低酰基结冷胶提取工艺。方法：将浓度为16.5g/L的结冷胶发酵液pH调至10，于80℃下保温20min，得低酰基结冷胶料液。料液经CaCl2絮凝菌体后用板框过滤除菌，滤液稀释6倍，加入碱性蛋白酶除蛋白，然后超滤浓缩4倍，再用活性炭脱色，最后用乙醇沉淀出结冷胶并干燥。结果：结冷胶回收率达76%，平均分子量为79万，透光率为86%，凝胶强度为890g/cm2。结论：使用该工艺提取低酰基结冷胶是可行的，产品质量符合相关标准。

结冷胶，絮凝，过滤，除蛋白，脱色

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

结冷胶发酵液 结冷胶浓度16.5g/L，酰基化率为6.02%；硅藻土、粉末活性炭、颗粒活性炭 溧阳市良友活性炭厂；考马斯亮蓝G-250 上海沃凯公司；工业滤布 杭州昌源工业滤布有限公司；葡萄糖醛酸标准品 百灵威公司；牛血清蛋白标准品、右旋糖苷标准品 sigma公司；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司；FeSO4·7H2O、Al2（SO4）3·18H2O、CaCl2均为分析纯。

Ultrospec 3300 Pro分光光度计 Amersham Biosciences公司；Eppendorf centrifuge 5810R离心机Eppendorf公司；TA.TX 21物性测试仪 STABLE MICROSYSTEM公司；小型板框过滤机 沈阳翔宇压滤机有限公司；UF6-1812卷式超滤膜 北京安得膜分离技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 保温时间对脱酰基工艺的影响 将发酵液pH调至10，80℃下保温脱酰基[3]，考察保温时间对脱酰基程度以及色素产生量的影响。

1.2.2 絮凝剂的选择 将低酰基结冷胶料液加水稀释4倍，在80℃下选择不同的絮凝剂分别于酸性、中性、碱性条件下进行絮凝实验，絮凝2min后测定界面高度和上清液结冷胶含量。

沉降率=（初始液面高度-沉降后界面高度）/初始液面高度

结冷胶损失率=（料液中结冷胶含量-上清液结冷胶含量）/料液中结冷胶含量

1.2.3 过滤除菌工艺 向低酰基结冷胶料液中加入适量絮凝剂，然后用板框过滤去除菌体。过滤介质为200目工业滤布，助滤剂为硅藻土，考察助滤剂用量（g/mL）及其添加方式、絮凝剂用量（g/mL）、过滤温度、操作压力、料液稀释倍数以及结冷胶酰基含量（%）对除菌效果的影响。

1.2.4 酶法除蛋白工艺 将除菌后的发酵液用水稀释6倍，加入蛋白酶，按照使用说明中的温度和pH进行酶反应，考察不同蛋白酶的除蛋白效果，以及除蛋白所需时间。

1.2.5 脱色工艺 将除蛋白后的料液用超滤进行浓缩，然后添加吸附剂，在pH10，80℃下保温一段时间进行吸附脱色，然后过滤除去吸附剂，得脱色后的滤液。

1.3 分析方法

1.3.1 菌体含量的测定 料液离心（5000r/min，15min）后用蒸馏水洗涤沉淀两次，并于75℃下干燥至恒重，称量得菌体含量。

1.3.2 结冷胶含量的测定 采用Bitter-Muir的咔唑法[8]测定其中葡萄糖醛酸含量，经换算得到结冷胶含量。

1.3.3 色素含量的测定 由可见光波长扫描结果可知，色素在400nm处有最大吸收，以此波长下的吸光率来表示色素含量。

1.3.4 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法测定。

1.3.5 分子量测定 采用凝胶过滤（GPC）进行测定。柱型号：60cm长，直径1.5cm（xk16，pharmacia biotech，swedan）；填充料：Fractogel EMD BioSEC（Merck ltd，UK）；检测器：折射检测器（RI）model 1755（bio-rad laboratories，Germany）；记录器：model YT1000（Howe co.ltd.UK）；洗脱液：75mmol/L氯化四甲铵，加入0.05%的叠氮化钠作为保护剂；洗脱液流速：25mL/h，蠕动泵（model P-1，Pharmacia Biotech，Sweden）。用66.9、182、509、1000ku的右旋糖苷标准品进行测定，绘制出标准曲线。取8mg的脱乙酰结冷胶样品溶解于2mL的洗脱液中，然后用过滤器（Whatman fiters GF/C，1.2μm孔径）过滤，去除残存细胞和不溶的结冷胶凝聚物，进样量0.2mL。

1.3.6 酰基含量的测定 参照秦方[9]的酸碱滴定法测定结冷胶中酰基的含量。

1.3.7 凝胶强度的测定 用TA.TX 21物性测试仪进行测定[10]。

1.3.8 透光率的测定 称取0.5g样品，加蒸馏水100mL，将烧杯置于80℃水浴中，样品溶解后加入2.7%的氯化钙溶液2mL，补充蒸发水量至原体积，趁热将胶溶液倾入比色皿，立即放入20℃恒温箱中放置15min。用分光光度计在497nm处测定透光率，用蒸馏水对照。

2 结果与讨论

2.1 保温时间对结冷胶酰基含量、料液色素产生量的影响

结冷胶料液在pH10，80℃下保温可脱掉酰基[3]。本实验中发酵液残留10g/L左右的葡萄糖，在碱性和高温环境下发生一系列反应使得发酵液颜色不断加深。保温时间过短酰基脱离不完全，时间过长发酵液颜色过深，增加后续脱色的难度，因此需要对保温时间进行研究。结果如图1所示，结冷胶的脱酰基率和发酵液色素产生量随保温时间的延长而增加。保温20min时，酰基已完全脱掉，继续延长保温时间只会增加发酵液色素含量，因此采用保温20min来制备低酰基结冷胶料液，下文中提到的低酰基料液都是在此条件下制备。

图1 保温时间对脱酰基程度、色素含量、菌体去除的影响

2.2 絮凝剂、pH对絮凝效果的影响

由于发酵液粘度较高，影响菌体絮凝颗粒的沉降，从而影响对絮凝剂性能的判断，因此将低酰基料液稀释4倍降低其粘度后进行絮凝实验。pH不仅能影响菌体表面所带电荷，而且还能影响絮凝剂的性质，因此对絮凝效果有显著影响[11]。如表1所示：酸性条件下壳聚糖和CaCl2没有絮凝效果，沉降率都为0；而Al2（SO4）3、FeSO4虽然絮凝效果较好，但是结冷胶损失较大，在50%左右。这是因为结冷胶是阴离子型线性聚合物[12]，在酸性条件下，分子间的静电作用力减弱容易沉淀下来。中性条件下，絮凝剂的絮凝效果都较弱，沉降率都小于0.3。碱性条件下，壳聚糖的絮凝效果仍然较差，而其余三种絮凝剂的絮凝效果较好，其中FeSO4的絮凝效果最好，沉降率和结冷胶损失率分别为0.81、0.15，其次是CaCl2，分别为0.7、0.17。但是使用FeSO4后，料液变成褐绿色，并且有焦臭味，考虑到食品的色泽和风味问题，选择CaCl2作为絮凝剂。

表1 不同絮凝剂的絮凝效果

2.3 过滤除菌工艺

通常情况下，菌体絮凝沉降后取上清液回收产品，但是当结冷胶浓度较高，料液粘度较大时，加入絮凝剂所形成的絮凝颗粒较小，沉降后上清液仍然比较浑浊。若要取得较好的菌体去除效果，需要将料液进行稀释，增加了处理量；并且废弃的絮凝颗粒含水量还很高，造成产品的回收率低，因此菌体絮凝后采用板框过滤来去除菌体。

2.3.1 助滤剂添加方式和操作压力的影响 1%的硅藻土以3种方式进行使用：a.全部加入到料液中；b.全部涂布在滤布上；c.将助滤剂按1:1的比例分别涂布在滤布上，加入到料液中。其中料液透过率=透过液体积/过滤前料液体积；过滤速率=透过液体积/（滤布面积×过滤时间）。

结果如图2所示：对于方式1，在压力小于0.1MPa的范围内，随着压力增高，过滤速率有所增加，但是料液透过率有所减小；当压力大于0.1MPa时，过滤速率和料液透过率急剧下降；对于方式2和方式3，过滤速率随压力的增大而增大，料液透过率也在0.7以上。这是因为方式2和方式3中絮凝菌体颗粒被助滤剂截留，不会堵塞滤布，而方式1中菌体颗粒直接将滤布堵塞；相同压力下方式3的过滤速率比方式2高，是因为方式2中涂布于滤布上的助滤剂量多，滤饼较厚，增大了过滤的阻力。因此助滤剂的添加方式应该采用方式3，压力选为0.2MPa。

图2 助滤剂添加方式对过滤效果的影响

2.3.2 过滤温度、氯化钙用量、助滤剂（硅藻土）用量、料液稀释倍数、酰基化程度对过滤除菌效果的影响 温度、氯化钙用量对低酰基结冷胶料液过滤除菌效果的影响如图3所示，温度越高分子热运动越强烈，菌体凝聚作用越弱，80℃除菌效果明显好于85℃。无CaCl2絮凝时，菌体去除率仅为0.2左右，当加入0.05%CaCl2时，菌体去除率可达到0.65左右。CaCl2用量的增加有助于除菌效果的增强，但当CaCl2用量增加到0.2%时，继续增加其用量除菌效果提高并不大。助滤剂用量以及稀释倍数对除菌效果的影响如图4和图5所示，稀释倍数越大，菌体去除效果越好；当助滤剂用量增大时，菌体去除效果随之增强。因此可以在80℃下通过增加CaCl2、助滤剂、稀释倍数来增强除菌效果，其结果如表2所示：增加CaCl2用量到0.25%，仅0.5%的助滤剂就使得结冷胶的损失率高达0.34，而且菌体去除率仅为0.75。增加稀释倍数到6倍，虽然菌体去除率为0.91，结冷胶损失率仅为0.1，但是稀释倍数过大工业应用并不经济。增加助滤剂用量至3%，此时菌体去除率和结冷胶损失率分别为0.94、0.13。因此应该采用增加助滤剂用量来增强除菌效果，除菌工艺参数选为：CaCl2用量0.05%，过滤温度80℃，助滤剂用量3%。并在此条件下研究了酰基化程度对除菌效果的影响，结果表明，酰基化程度越高，菌体去除率越低。目前人们对菌体絮凝机理认识还不多[13]，没有相关的理论支持。本实验中酰基化程度对菌体去除有较大影响可能是因为结冷胶通过酰基与细胞缠绕在一起，屏蔽了絮凝剂对菌体的絮凝作用。

图3 温度、CaCl2用量对除菌效果的影响注：0.5%硅藻土，pH10。

图4 助滤剂用量以及稀释倍数对除菌效果的影响注：0.05%CaCl2，80℃，pH10，发酵液未稀释。

图5 稀释倍数对菌体去除效果的影响注：0.05%CaCl2，80℃，pH10，助滤剂0.5%。

表2 不同除菌方式对结冷胶损失的影响（80℃，pH10）

2.4 酶法除蛋白工艺

2.4.1 不同蛋白酶除蛋白效果的比较 结冷胶的结构十分稳定，不易受酶的影响而引起降解[14]，可以使用酶来去除蛋白质。选择不同的蛋白酶在其最适条件下进行反应，由于此类酶在高温下容易失活，而高浓度的结冷胶料液在低温静止状态下会形成凝胶，因此需将料液稀释6倍，并不断搅拌进行酶反应。蛋白去除效果如表3所示，其中碱性蛋白酶的除蛋白效果最好。这是由于碱性蛋白酶可能更适合水解料液中的蛋白质，而且碱性条件下结冷胶溶液的粘度较低，传质效率较高，酶反应速率较快。

表3 不同蛋白酶除蛋白效果

2.4.2 反应时间对碱性蛋白酶除蛋白的影响 由图6可以看出，随着碱性蛋白酶作用时间的延长，蛋白质的去除率逐渐增加，到4h后蛋白质去除率不再增加，因此蛋白酶的作用时间选为4h。

图6 反应时间对蛋白去除率的影响

2.5 脱色工艺

由于除蛋白工艺中将料液稀释了6倍，增加了处理量，因此采用超滤进行浓缩，这样不仅可以降低后续工艺的处理量，而且能去除一部分小分子物质如色素、氨基酸等。

2.5.1 浓缩倍数对膜通量的影响 超滤过程在pH10， 80℃，0.05MPa（表压）下进行，膜通量随浓缩倍数的增大而减小，如图7所示。这是因为结冷胶浓度在不断增大，料液的粘度也随之增加；另一方面，膜在不断被污染，导致膜通量的减少。当浓缩倍数为4倍时（此时体积为原始发酵液的1.5倍）停止超滤。超滤过程能除去一部分色素，剩下的色素采用吸附脱色的方法来去除。

图7 膜通量与浓缩倍数的关系

2.5.2 脱色剂的选择 向pH10，80℃料液中分别加入经过预处理的强碱性离子交换树脂（D750、D730、D301），大孔吸附树脂（SD300）以及活性炭（粉状、颗粒状），磁力搅拌40min进行脱色。结果如表4所示，其中粉末活性炭的脱色效果最好。这可能是因为脱色时间较短，色素还没有及时进入树脂孔内，而粉末活性炭由于比表面积较大，在短时间内容易吸附色素，因此色素去除率较高。工业上较长时间保温不仅增加成本，而且生产效率低，采用树脂脱色是不经济的，因此采用活性炭脱色。

表4 不同脱色剂的脱色效果（pH10，40min）

3 结论

通过以上研究得出了提取低酰基结冷胶的相关工艺：将浓度为16.5g/L的结冷胶发酵液pH调至10，80℃下保温20min，得低酰基结冷胶料液。80℃下加入0.05%CaCl2絮凝菌体后用板框过滤除菌，过滤介质为200目工业滤布，助滤剂为硅藻土，添加量为3%，平均分配于料液和滤布。滤液用水稀释6倍后加入0.3%的碱性蛋白酶，pH10，55℃下保温4h。蛋白水解后在80℃下将料液超滤浓缩4倍，然后添加1%活性炭，并于80℃保温40min，过滤除去活性炭后，滤液用3倍体积的乙醇沉淀结冷胶。结冷胶回收率为76%，平均分子量为79万，透光率为86%，凝胶强度为890g/cm2。

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Study on extraction method of deacetylated gellan gum

LIANG Tao,XU Xiao-qin,HUANG Jin,CAI Jin,XU Zhi-nan*
（Department of Chemical and Biological Engineering of Zhejiang University,Hangzhou 310027,China）

Objective:Develop a method for extracting deacetylated gellan gum from high viscosity broth.Method: Keep fermentation broth at 80℃，pH10 for 20min to make gellan gum deacetylated.Then add CaCl2to flocculate cells，and the solution was filtrated to remove cell mass.After cell removing，the solution was diluted and alkaline protease was added to remove protein.Then concentrate the solution with ultrafiltration and remove the pigment using active carbon.At last deposit the gellan gum with alcohol，after drying the refined product was made. Result:The total recovery，molecular weight，transparency，gel strength of deacetylated gellan gum was 76%， 790 000，86%，890g/cm2respectively.Conclusion:The method was feasible for extracting deacetylated gellan gum，and the product is in accordance with related standard.

gellan gum；flocculation；filtration；deproteinization；decolorization

TS201.2

B

1002-0306（2011）10-0368-05

结冷胶是美国Kelco公司于20世纪80年代新开发出来的阴离子型微生物线形多糖[1]，其单体含2分子D葡萄糖、1分子D葡萄糖醛酸和1分子L鼠李糖。运用光散射法及特性粘度法测得脱酰基产品的分子量在0.5～1.0×106u之间[2]。结冷胶可分为高酰基和低酰基两种类型，一般经微生物直接合成的结冷胶富含乙酰基和甘油酰基，称为高酰基结冷胶；将其经过碱处理脱掉酰基就可得到低酰基结冷胶[3]。低酰基结冷胶不仅稳定，而且具有良好的凝胶性能，与传统凝胶剂（如卡拉胶、琼脂等）相比，仅需0.25%的用量，即可达到1.5%琼脂和1%卡拉胶所能达到的凝胶强度，因此低酰基结冷胶在食品、医药、科研等领域有着广泛用途[4-6]，具有良好的市场前景。食品和医药用的优质结冷胶产品需要精制，而结冷胶是高粘性的微生物代谢产物，胶体围绕细胞以粘性聚合物的形式构成网状结构[7]，给结冷胶的提取带来了不小的困难。目前的研究主要集中在发酵方面，提取工艺报道较少。在实验室一般是将发酵液大量稀释后降低其粘度，然后离心除去菌体，此方法在工业应用上并不经济，因此对适合工业化的提取工艺进行研究具有重要意义。

2010-10-25 *通讯联系人

梁涛（1986-），男，在读硕士研究生，主要从事多糖分离研究。