碱溶酸沉法提纯玉米浸泡水粗蛋白的工艺优化
2011-11-02鲁晶晶郑喜群刘晓兰刘志胜
鲁晶晶,郑喜群,*,刘晓兰,刘志胜
(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江省高校农产品加工重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;2.美国北达科他州立大学谷物与食品科学系,美国北达科他州581052)
碱溶酸沉法提纯玉米浸泡水粗蛋白的工艺优化
鲁晶晶1,郑喜群1,*,刘晓兰1,刘志胜2
(1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院,黑龙江省高校农产品加工重点实验室,黑龙江齐齐哈尔161006;2.美国北达科他州立大学谷物与食品科学系,美国北达科他州581052)
以玉米浸泡水粗蛋白为原料,通过单因素实验初步确定碱溶酸沉法提纯玉米浸泡水粗蛋白的条件。在单因素基础上选取影响蛋白质提纯效果明显的三个因素:碱溶阶段pH、浸提时间、料液比,进行响应面设计。得到了优化的提纯条件:温度45℃,碱溶阶段pH12,浸提时间20min,料液比(W∶V)1∶35、酸沉阶段pH5.5。在此条件下,玉米浸泡水的蛋白质含量为91.84%,提取率为70.06%。
玉米浸泡水,蛋白,提纯,优化
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
玉米浸泡水 青冈龙凤淀粉厂;玉米浸泡水粗蛋白 实验室自制,壳聚糖絮凝提取冷冻干燥后,100目过筛,蛋白质26.44%、水分9.34%、总糖0.62%、总酸1.15%、脂肪1.02%、灰分30.66%;其他试剂 分析纯。
Wmzk-72电热恒温水浴锅 上海跃进机械厂;Thermo702型低温冰箱 赛默飞世尔科技公司;TDL-5-A台式离心机 上海安亭科技仪器厂;PHS-3C型pH计 上海精密科学仪器有限公司;全自动凯氏定氮仪 瑞士步琪公司。
1.2 实验方法
1.2.1 玉米浸泡水粗蛋白的制备
1.2.1.1 玉米浸泡水粗蛋白的制备 用壳聚糖絮凝的方法从玉米浸泡水中提取[5]。取玉米浸泡水1000mL,调节浸泡水pH6.9,添加10g/L壳聚糖溶液,60r/min搅拌35min,静置30min,离心,沉淀物干燥,粉碎,100目过筛,于常温保存备用。玉米浸泡水粗蛋白中蛋白质含量的测定采用常量凯氏定氮法。
1.2.1.2 玉米浸泡水粗蛋白的提纯步骤 称取2.0g玉米浸泡水粗蛋白,溶于蒸馏水中,用0.5mol/L NaOH调节pH,恒温水浴振荡浸提20min,然后3500r/min离心20min,残渣按上述方法再提取一次,合并两次提取的上清液,用0.5mol/L HCl分别调pH,静置30min,有沉淀析出,3500r/min离心20min,弃去上清液,沉淀冷冻干燥,玉米浸泡水蛋白,进行三次平行实验。
1.2.2 碱溶酸沉单因素实验
1.2.2.1 碱溶阶段最适pH的确定 按料液比1∶25(w∶v),分别调节pH至9、10、11、12、13、14,于25℃浸提30min,酸沉阶段调pH至5.0,研究碱溶阶段pH对蛋白质提取率及蛋白质纯度的影响,确定适宜的碱溶阶段pH。
1.2.2.2 适宜温度的确定 碱溶阶段pH为12,分别选择温度为25、35、45、55、65℃,其他条件同1.2.2.1,确定适宜的浸提温度。
1.2.2.3 适宜料液比的确定 分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45(w/v),碱溶阶段pH为12,浸提温度为45℃,其他条件同1.2.2.1,确定适宜的料液比。
1.2.2.4 适宜浸提时间的确定 按料液比1∶35(w/v),碱溶阶段pH为12,浸提温度45℃,分别选择浸提时间为10、20、30、40、50、60min,其他条件同1.2.2.1,确定适宜的浸提时间。
1.2.2.5 适宜酸沉阶段pH的确定 按料液比1∶35(w/v),碱溶阶段pH为12,浸提温度为45℃,浸提时间为20min,分别调酸沉阶段pH至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,确定适宜的酸沉阶段pH。
1.2.3 响应面实验 根据单因素实验结果,采用Box-Behnken进行实验设计。以料液比、碱溶阶段pH、浸提时间为自变量,提纯后玉米浸泡水蛋白纯度为响应值,设计3因素3水平共15个实验点的响应面分析实验[6]。利用Design Exeprt软件进行数据处理和回归分析。实验设计方案如表1所示。
表1 实验因素和水平
1.2.4 玉米浸泡水粗蛋白的分析
1.2.4.1 玉米浸泡水粗蛋白成分的分析[7]水分、灰分、总糖、总酸、脂肪、蛋白质的测定分别按照GB5009.3-2003直接干燥法、GB5009.4-2003、蒽酮-硫酸法、滴定法、GB5512-1985索氏提取法、GB5009.5-85常量凯氏定氮法测定。
1.2.4.2 蛋白质提取率的计算
式中:C0-玉米浸泡水粗蛋白的蛋白质含量,%(w/w);C1-提纯后样品蛋白质含量,%(w/w)。
1.2.4.3 蛋白质纯度 碱溶酸沉提纯后的玉米浸泡水蛋白质样品中蛋白质含量(用常量凯氏定氮法测定)。
2 结果与讨论
2.1 碱溶酸沉提纯玉米浸泡水粗蛋白的单因素实验结果
2.1.1 碱溶阶段适宜pH的选择 蛋白质是两性电解质,pH的变化会改变其带电情况,直接影响蛋白质-蛋白质、蛋白质-溶剂的相互作用,从而使蛋白质的溶解性发生变化。因此,有必要研究碱溶阶段pH对蛋白质纯度及回收率的影响。按照1.2.2.1实验方法进行实验,碱溶阶段适宜pH对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果的影响如图1所示。
图1 碱溶阶段pH对玉米浸泡水粗提纯效果的影响
由图1可知,随着pH从9增加到12,样品蛋白纯度和提取率均逐渐增大,碱液对蛋白质分子的次级键特别是氢键具有破坏作用,并可使某些极性基团发生解离,使蛋白质表面分子具有相同的电荷,从而对蛋白质分子具有增溶的作用。所以,随着溶液pH的逐渐增大,提取率及蛋白纯度也逐渐增大;pH大于12时,蛋白纯度和提取率均减小;当pH14时,蛋白纯度最小,甚至比玉米浸泡水粗蛋白的纯度还低。分析可能是pH过高使蛋白质发生变性,导致蛋白质内部结构及空间构象遭到破坏,失去原来的天然性质,使得最后得到的蛋白纯度极低。因此,确定pH12为适宜碱溶阶段pH。
2.1.2 适宜温度的选择 按照1.2.2.2实验方法进行实验,温度对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果的影响如图2所示。
由图2可以看出,随着温度的升高,蛋白纯度及提取率均有所下降,但变化不明显。蛋白质在不同温度条件下有不同的溶解度,尤其对于含有较多疏水性氨基酸的玉米浸泡水粗蛋白来讲,在碱性条件下的溶解性比较好,但当温度升高时疏水基团会暴露出来,形成由二硫键连接的高分子量不溶聚合物,使蛋白质在溶液中的溶解度下降,在碱溶过程结束后,离心弃去沉淀收集上清液的环节中损失掉,将这部分不溶的固形物离心弃去,导致碱溶酸沉后的蛋白纯度及提取率降低。在实验所选择的温度范围内,25℃时,蛋白纯度及提取率均最高。但考虑到淀粉厂生产淀粉时产生的玉米浸泡水的实际温度为45℃,所以,最终确定适宜的提取温度为45℃,更有益于实现工业化生产。
图2 温度对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果的影响
2.1.3 适宜料液比的选择 料液比在一定范围内的提高可以大大提高蛋白质的提取率,较高的料液比可以降低体系的粘度,加快传质的过程;料液比小时,溶液的粘度较大,将影响传质过程的进行;而适宜的料液比可以促进原料与溶液的接触[8]。所以,选择适宜的料液比尤为重要。按照1.2.2.3实验方法进行实验,料液比对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果的影响如图3所示。
图3 料液比对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果的影响
由图3可知,在实验所选的料液比范围内,随着料液比的增大,样品蛋白质的纯度及提取率呈先增大后减小的趋势。料液比为1∶35时蛋白纯度及提取率都最大,继续增加料液比,两项指标都有下降。含水量多少直接影响传质过程的相互作用,料液比过大时,料液体系分散不均匀,不利于蛋白质的充分溶解,使得蛋白质的提取率偏低,提取出来的样品中有效蛋白含量没有增加;同时,料液比过大,提取时消耗大量的碱和水,所得提取液的蛋白质浓度非常低,大大增加了后处理的负担,产品成本增加,会带来一定的负面影响。因此,适宜料液比为1∶35。
2.1.4 适宜浸提时间的选择 按照1.2.2.4实验方法进行实验,浸提时间对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果的影响如图4所示。
图4 浸提时间对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果的影响
由图4可以看出,随浸提时间的延长,蛋白质纯度及提取率呈现先增加后降低的趋势,在50min时提取率又有微小的增加,之后提取率继续下降。分析得出上述结果的原因:第一可能是溶剂接触到蛋白质需要一定的时间,才能使蛋白质逐步水化而缓慢地溶出,时间过短,溶剂与蛋白质接触不充分,溶质溶解效果不好;浸提时间过长,溶质饱和,溶解效果反而下降,导致溶质缓慢溶出,降低了溶质的溶解度;第二可能是样品结构的松散程度越来越接近于极限,蛋白质从样品中进入提取液主体的传质速率明显降低,使提取率增加平缓[9]。因此,确定适宜浸提时间为20min。
2.1.5 适宜酸沉阶段pH的选择 本文选取碱溶液将蛋白质充分溶解,为了收集蛋白质就需要将其从碱溶液中析出,所以酸沉阶段pH也有可能影响着蛋白质的纯度及提取率,也就有必要考察酸沉阶段pH对蛋白质提纯效果的影响,按照1.2.2.5实验方法进行实验,如图5所示。
图5 酸沉阶段pH对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果的影响
由图5可以看出,酸沉阶段玉米浸泡水粗蛋白的蛋白纯度及提取率随pH变化呈先增大后减小的趋势,在pH5.5时,均达到最大值,分别为88.00%、68.74%。蛋白质是两性电解质,在某一pH的溶液中,它所带的正电荷与负电荷数恰好相等,即净电荷为零,此时蛋白质间静电排斥作用最低,蛋白质聚集、沉淀,溶解度最低,从溶液中析出。因此,酸沉阶段适宜pH为5.5。
2.2 响应面法优化碱溶酸沉提纯玉米浸泡水粗蛋白的适宜条件
2.2.1 实验结果 采用三因素三水平的响应面法,优化碱溶酸沉提纯玉米浸泡水粗蛋白的工艺条件。按照1.2.3方法实验,结果见表2。
2.2.2 模型的建立及显著性检验 运行Design Exeprt软件,对表2的结果进行二次项拟合,在α=0.05水平上用逐步回归法予以简化,求得玉米浸泡水蛋白纯度对料液比(A)、碱溶阶段pH(B)、浸提时间(C)的二次多项回归模型:
对该回归模型及回归方程的各项系数进行方差分析、显著性检验,结果如表3所示。
表3 方差分析结果
从表3可以看出:模型P=0.0011<0.01,表明模型方程高度显著,即不同条件对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果影响高度显著;整个模型的R2为0.9791,说明模型可以解释97.91%实验所得玉米浸泡水蛋白提取纯度的变化,模型的拟合度较好,可以用于碱溶酸沉法提纯玉米浸泡水粗蛋白实验的理论预测。
由表3的回归方程的各项系数显著性检验可知,二次项(P=0.0002<0.05)对玉米浸泡水粗蛋白提纯效果影响高度显著,一次项(P=0.0451<0.05)影响较显著,而交互项(P=0.2078>0.05)作用不显著。
2.2.3 玉米浸泡水粗蛋白碱溶酸沉提纯工艺的响应面分析与优化 根据回归模型,做出相应的响应曲面图,如图6所示。
由图6可知,各因素对响应值的影响趋势可通过这组图直接反映出来。B(碱溶阶段pH)对响应值的影响较大,表现为曲线较陡;A(料液比),C(浸提时间)对响应值的影响均较小,表现为曲线相对平滑。另外,回归方程存在稳定点,即极大值点,通过岭嵴分析(ridge analysis)得到极大值。所对应的各主要因素 (A,B,C) 的编码值分别为 (0.020158,-0.103079,0.009576),即适宜条件是:料液比(W∶V)1∶35.10﹑碱溶阶段pH 11.90﹑浸提时间20.10min,在此条件下,蛋白质纯度的理论值为92.38%。为检验响应曲面法所得结果的可靠性,采用上述优化提纯条件进行玉米浸泡水粗蛋白提纯,考虑到实际操作的便利,将提取工艺参数修正为:料液比(W∶V)1∶35,pH12,时间20min。在此条件下提纯,实际测得的样品蛋白质含量为91.84%,与理论值较接近。因此,基于响应面法所得的优化提纯工艺参数准确可靠,进一步验证了数学回归模型的合适性。
图6 玉米浸泡水粗蛋白经碱溶酸沉提纯后沉淀的蛋白纯度的响应面图
3 结论
通过单因素实验及响应面实验优化了碱溶酸沉方法提纯玉米浸泡水粗蛋白的适宜工艺条件。即:温度45℃;碱溶阶段pH12;浸提时间20min;料液比(W∶V)l∶35;酸沉阶段pH5.5,提纯后玉米浸泡水蛋白的纯度可达到91.84%,达到了玉米浸泡水分离蛋白的水平。
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Optimization of purification technology for corn steep water crude protein by alkali-solution and acid-isolation
LU Jing-jing1,ZHENG Xi-qun1,*,LIU Xiao-lan1,LIU Zhi-sheng2
(1.Heilongjiang Provincial Key University Laboratory of Processing Agricultural Products,College of Food and Bioengineering,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China;2.North Dakota State University,ND 581052,USA)
The corn steep water crude protein was purified by alkali-solution and acid-isolation.The preliminary conditions were determined through single factor test.By using of response surface analysis experiment,the effects of alkali soluble pH,extracting time,solid-liquid ratio on the protein purity were studied on the base of the single-factor test.The results showed that the optimum conditions were as following:temperature 25℃,alkali soluble pH 12,extraction time 20min,solid-liquid ratio(W∶V)1∶35 and acid subside pH 5.5.Under the best conditions,the protein purity was 91.84%and the yield of protein was 70.06%.
corn steep water;protein;purification;optimization
TS210.1
B
1002-0306(2011)10-0321-05
在玉米淀粉湿法生产过程中,首先需要浸泡,每处理1t玉米,约产生0.8m3的浸泡水[1]。玉米浸泡水中含有大量有价值的物质,如蛋白质、可溶性氨基等。目前,大多数淀粉厂(尤其是小型淀粉厂)不能对玉米浸泡水进行充分开发利用,而是将玉米浸泡水浓缩成玉米浆作为饲料出售或者直接排放掉,这样不仅耗费大量热源,造成资源的浪费,还会导致环境污染[2]。因此,对玉米浸泡水加以利用,尤其是将其中3%~4%的蛋白质提取出来就显得尤其重要,既可以变废为宝,减少环境危害,还能大大提高经济效益。玉米浸泡水中蛋白质的提取方法,主要有等电点法、三氯乙酸沉淀法等。等电点法分离出的蛋白质不到玉米浸泡水中蛋白质总量的40%,大部分造成浪费;三氯乙酸沉淀法,蛋白质回收率为65.3%[3],但三氯乙酸本身有微毒,给蛋白质的利用带来一定的问题,不能直接加以利用。本课题组也研究过利用壳聚糖絮凝剂直接从玉米浸泡水中提取玉米浸泡水蛋白,但是得到的蛋白纯度不够,提取率不高。因此,有必要寻求一种安全可靠、成本低、易于实现操作的提取玉米浸泡水蛋白质的方法。碱溶酸沉法是分离提取蛋白质应用的最多而且已用于产业化的方法,该法具有操作简单、易于控制、成本低廉等优点[4]。本实验以采用壳聚糖絮凝方法提取的玉米浸泡水粗蛋白为原料,利用碱溶酸沉的方法,进一步提纯玉米浸泡水粗蛋白,并用响应面法优化提纯工艺条件,探讨碱溶阶段pH、浸提时间、料液比等因素对提纯后玉米浸泡水蛋白质含量的影响,确定适宜工艺参数,为玉米浸泡水蛋白的开发利用提供理论依据和参考。
2010-12-28 *通讯联系人
鲁晶晶(1986-),女,硕士研究生,主要从事农产品加工及贮藏方面的研究工作。
黑龙江省海外学人资助项目(1153h24)。