芦根多糖的分离纯化和体外抗肿瘤研究

晁若瑜，杨靖亚，2，*，蔡晓晔，陆晓帆，钱媛华

(1.上海海洋大学，上海201306;2.上海海洋大学海洋科学研究院，上海201306)

芦根多糖的分离纯化和体外抗肿瘤研究

晁若瑜1，杨靖亚1，2，*，蔡晓晔1，陆晓帆1，钱媛华1

(1.上海海洋大学，上海201306;2.上海海洋大学海洋科学研究院，上海201306)

从芦根中提取和纯化了芦根多糖，并研究其体外抗肿瘤活性。采用热水浸提法从芦根中提取芦根多糖，经Sevag法脱蛋白，冷冻干燥后，葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，得到纯化的芦根多糖，苯酚－硫酸法测定多糖样品中总糖含量，凝胶层析测定多糖分子量，细胞毒性实验研究其体外抗肿瘤作用。结果测得芦根多糖样品中总糖含量为0.872%，分离纯化得到三种芦根多糖组分R－PolyⅠ、R－PolyⅡ、R－PolyⅢ，三者的分子量分别为79781、29073、10605u，细胞毒性实验表明三种芦根多糖组分对Hela细胞和B16细胞均具有良好的抑制作用。这为芦根多糖在食品工业及医药保健等领域的应用奠定了基础。

芦根多糖，提取，纯化，抗肿瘤

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦根 购于北京永安堂药店，产地河北; SephadexG－100 美国Sigma公司;Dextran－T－10、T－40、T－70、T－100 瑞典Pharmacia公司;RPMI1640培养基、胎牛血清 Gibco公司;MTT 购于上海实生细胞生物技术有限公司;无水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、95%乙醇、苯酚、浓硫酸 均为分析纯，购于国药。

微波炉 WP700IP17，美的;双列四孔恒温水浴锅 HWS－24，上海慧泰仪器制造有限公司;低速自动平衡离心机 TDZ4A－WS，上海沪湘仪离心机仪器有限公司;旋转蒸发器RE－52A、恒流泵BF－100上海青浦沪西仪器厂;循环水多用真空泵SHZ－3、层析柱(1.6×40cm) 上海沪西分析仪器厂有限公司; 721紫外分光光度计 上海越平科学仪器有限公司; CO2培养箱NAPC06500 法国JOUAN公司;酶标仪Model－680，Bio－Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦根多糖的提取 称取干燥芦根150g，0.5% NaHCO3溶液50℃水浴浸泡24h，室温下，以蒸馏水洗净芦根。首先以料水比1∶3，大火(700W)微波提取8min，再在120℃，磁力搅拌条件下热水浸提3h，抽滤，滤液进行减压浓缩后，搅拌下加入950mL/L乙醇，调醇含量至650mL/L，4℃静置过夜，离心10min (3000r/min)，弃去上清液，沉淀先后用丙酮、无水乙醇洗2次，真空干燥挥去有机溶剂即得芦根多糖的粗品［5］。

将芦根多糖粗品用去离子水溶解转移至100mL烧杯中，以Sevag法去除蛋白质，加入氯仿－正丁醇(4∶1)溶液，振荡10min，于分液漏斗萃取，保留上层萃取液，该操作重复2次。萃取液进行减压浓缩后，搅拌下加入950mL/L乙醇，调醇含量至650mL/L，4℃静置过夜，离心10min(3000r/min)，弃去上清液，沉淀先后用丙酮、无水乙醇洗2次，真空干燥，即得芦根粗多糖［6］。

1.2.2 芦根多糖的含量测定

1.2.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 精密称取充分干燥至恒重的10mg葡萄糖标准品，加去离子水溶解，配制100mL标准溶液，标准溶液浓度为0.1g/L。分别吸取配制好的葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL，分别加去离子水至2mL，加入5%的苯酚溶液1mL，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸显色，振荡5min，在沸水浴上加热15min，取出后于冷水浴中冷却30min。以空白为参比，用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度值。

1.2.2.2 芦根多糖的含量测定 取芦根多糖100.0mg置于100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。准确吸取0.25、0.5、1.0mL分别置于10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。精密吸取上述溶液各1.0mL，按葡萄糖标准曲线项下操作，测定吸收度。

1.2.3 芦根多糖的分离纯化 选取1.6cm×40cm凝胶层析柱，有效长度为35cm，床体积为80mL。以0.1mol/L NaCl溶液对Sephadex G－100凝胶进行预处理。将冷冻干燥好的芦根多糖溶于0.1mol/L NaCl溶液中，制成50mg/mL的芦根多糖溶液。准确吸取该溶液1.5mL上样，以0.1mol/L NaCl溶液洗脱，调节流速，每6min收集一管，每管3mL［7］。硫酸－苯酚法逐管检查各管洗脱液的吸光度，得三种多糖组分，见图1，分别命名为R－PolyⅠ、R－PolyⅡ、R－PolyⅢ。收集糖反应阳性高峰，洗脱液经旋转蒸发浓缩，经乙醇沉淀，静置过夜后用无水乙醇及丙酮洗涤，冷冻干燥。

1.2.4 芦根多糖的分子量测定 用Sephadex G－100 (1.6×40cm)测定芦根多糖分子量，取T－10、T－40、T－70、T－100的标准多糖各100mg溶解后上柱，以0.1mol/L NaCl溶液洗脱，调节流速，每6min收集一管，每管3mL。硫酸－苯酚法跟踪检测，测出洗脱体积Ve，另以相对分子量200万的蓝色葡聚糖上柱，得外水体积V0，以Ve/V0为横坐标，以相对分子量的对数为纵坐标得标准曲线。再以同样的条件将芦根多糖上柱，测定洗脱体积，在标准曲线上查出相对分子量［8］。

1.2.5 细胞毒性实验 Hela细胞及B16细胞为华东理工大学药学院提供，用含 10%胎牛血清的RPMI1640培养基传代、培养。

分别接种培养至对数期的Hela细胞和B16细胞的细胞悬液于96孔板中，每孔100μL，细胞数为1× 104个/孔，置37℃、5%的CO2培养箱培养24h。药物组每孔加100mL的不同浓度(2、4、8、10mg/mL)的三种多糖液，对照组加100μL的细胞培养液，设5个复孔。培养24h后每孔加入5mg/mL MTT 10μL，继续培养4h，吸弃上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，震荡10min后用酶标仪在490nm处测定其OD值，根据公式计算细胞的生长抑制率。

抑制率(%)=(1－多糖组OD/对照组OD) ×100%［9］

图1 芦根多糖洗脱曲线

2 结果与分析

2.1 芦根多糖的理化性质

芦根多糖为白色粉末，无臭、无味，溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，水溶液为透明或淡黄色。苯酚－硫酸法检测呈阳性。

2.2 芦根多糖的含量

绘制的葡萄糖标准曲线见图2，其线性回归方程为y=18.412x－0.0009(r=0.9995)。测得芦根多糖的吸光度分别为0.391、0.847、1.552。根据回归方程求出多糖含量分别为851.4、921.0、843.4mg/g，平均含量为871.9mg/g。

图2 葡萄糖标准曲线

2.3 芦根多糖的分离纯化

芦根多糖经凝胶柱层析，硫酸－苯酚法测定洗脱液的吸光度后得到三种多糖组分，见图1，分别命名为R－PolyⅠ、R－PolyⅡ、R－PolyⅢ。收集三种多糖的洗脱液经旋转蒸发浓缩，乙醇沉淀，静置过夜后用无水乙醇及丙酮洗涤，冷冻干燥。

2.4 芦根多糖的分子量

四种标准多糖T－10、T－40、T－70、T－100的洗脱地指导企业生产，同时也为相似类型产品的保藏提供参考。

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Extraction，purification and anti－tumor activity of Reed Rhizome polysaccharide

CHAO Ruo－yu1，YANG Jing－ya1，2，*，CAI Xiao－ye1，LU Xiao－fan1，QIAN Yuan－hua1
(1.Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China; (2.Institute of Marine Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

The polysaccharide was extracted from Reed Rhizome，the technology of its isolation，purification and anti－tumor activity were also studied.The polysaccharide was obtained through hot water extraction，then protein was removed by means of Sevag methods and purified by Sephadex chromatography.And the vitro anti－tumor activities were analyzed with cytotoxicity.The results showed that the saccharide content of the sample was 0.872%. Three kinds of polysaccharide(R－PolyⅠ，R－PolyⅡ，R－PolyⅢ)were obtained through the isolation and purification procedure，with their molecular weight estimated as 79781，29073，10605u respectively.Besides，the three polysaccharides displayed a noticeable inhibition effect in Hela and B16 cells.It laid the foundation for the wide application of the R－Poly in such fields as food industry and health care.

Reed Rhizome polysaccharide;extraction;purification;anti－tumor

TS201.2+3

B

1002－0306(2011)12－0284－03

芦根(Reed Rhizome)系禾本科植物芦苇(Phragmites communis Trin.)的新鲜或干燥根茎，具有悠久的药用及食用历史，属清热泻火药［1］。性甘、味寒，归肺、胃经。传统中医药认为芦根清热生津、舒肝解郁、除烦、止呕、利尿。主要用于热病烦渴、胃热呕吐、肺热咳嗽、肺痈吐脓、热淋涩痛等的治疗。在多本草药图志及医家经典中有所记载。芦根中含有多种化学成分，现代研究发现芦根含有51%的糖类、5%的蛋白质、1%的脂肪及多种有机酸、维生素和微量元素［2］，其中以多糖成分为近年来的研究热点。研究表明，芦根多糖具有一定保肝作用［3－4］，但目前对于芦根多糖的理化性质及活性等方面尚未有系统而全面的研究。笔者在前期实验的基础上，对芦根多糖的理化性质和体外抗肿瘤作用进行研究分析，希望能够为探索其作为新药品基料及食品功能性成分资源的可行性提供依据，并为芦根的综合利用提供理论基础。

2011－08－25 *通讯联系人

晁若瑜(1986－)，女，在读硕士，研究方向:海洋药物。

上海市教育委员会科研创新项目(09YZ265);上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704)。