宣木瓜粗提物抑菌作用的研究

王旭东，董 明，李 娜，张国庆，俞雅琼

(安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036)

宣木瓜粗提物抑菌作用的研究

王旭东，董 明*，李 娜，张国庆，俞雅琼

(安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥230036)

为了研究宣木瓜粗提物的抑菌作用以及紫外光和温度对其抑菌作用的影响，以95%乙醇和蒸馏水作为溶剂，采用水浴振荡法对宣木瓜粗提物进行提取。采用平板打孔法测定宣木瓜不同粗提物对荧光假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和四联球菌的抑菌作用以及最低抑菌浓度和最低杀菌浓度。结果表明，宣木瓜95%乙醇粗提物和蒸馏水粗提物对5种有害菌都有明显的抑制作用，而且95%乙醇粗提物的抑菌作用优于蒸馏水粗提物，两种粗提物均有较好的紫外光稳定性和热稳定性。

宣木瓜，乙醇粗提物，蒸馏水粗提物，抑菌作用，平板打孔法

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宣木瓜 采自安徽省宣城新田区宣木瓜生产基地，罗汉脐品种，切片，60℃烘干至恒重，然后用DFT－100多功能粉碎机将其粉碎，备用;荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、四联球菌(Micrococcus tetragenus) 由安徽农业大学微生物实验室提供;大肠杆菌(Escherichia coli)菌株编号:CICC44825、枯草芽孢杆菌(Bacillus subfilis)菌株编号:CMCC26003、金黄色葡萄球菌(Staphylocaccus aureus)菌株编号: CMCC63501 以上菌种由广东微生物种质资源库提供。

LDZX－40型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;FA2104万分之一电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;ZK型系列组合式冷库 中国常州银雪制冷设备有限公司;SHA－B双功能水浴恒温振荡器 金坛市杰瑞尔电器有限公司; HH－4恒温水浴锅 国华电器有限公司;DHG－9140A型电热恒温鼓风干燥器 上海一恒科技有限公司;T6新世纪紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;SPX－150B－Z型MODEL生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;无菌操作台 苏州净化设备有限公司;RE－52A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;SHZ－D(Ⅲ)循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂;直径6mm不锈钢打孔器，DFT－100多功能中药粉碎机。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 宣木瓜→切片、60℃烘干→粉碎成粉末状→水浴振荡浸提→过滤、浓缩、干燥→配成不同浓度的生药→抑菌实验→稳定性实验

1.2.2 粗提物的制备

1.2.2.1 宣木瓜95%乙醇粗提物的制备 称取10.00g宣木瓜粉末，采用95%乙醇，料液比为1∶8 (g∶mL)，在60℃水浴振荡器中提取2次，每次1h，纱布过滤，合并两次滤液，在旋转蒸发仪上60℃浓缩至浸膏状，再经真空干燥至无乙醇味，然后用DMSO试剂定容至20mL，此时生药浓度为500.00mg/mL，存放于4℃冰箱中，抑菌备用。

1.2.2.2 宣木瓜蒸馏水粗提物的制备 称取10.00g宣木瓜粉末，采用蒸馏水，料液比为1∶8(g∶mL)，在60℃水浴振荡器中提取2次，每次1h，纱布过滤，合并两次滤液，在旋转蒸发仪上60℃浓缩至20mL，此时生药浓度为500.00mg/mL，存放于4℃冰箱中，抑菌备用。

1.2.3 培养基的制备［6］牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(BPA):牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1000mL。pH(7.4±0.2)，121℃灭菌20min。

1.2.4 菌悬液的制作

1.2.4.1 菌种的活化 培养基:牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、四联球菌在37℃恒温箱培养24h，荧光假单胞菌在28℃恒温箱培养24h，转接2次，得到长势良好的菌种，然后置于0～4℃下冷藏备用。

1.2.4.2 菌悬液的制备 挑取一环活化好的菌种接种到已灭菌的含有20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，150r/min摇床培养，用已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基调整，采用平板计数法使其菌悬液浓度大约为107～108CFU/mL，存放于4℃的冰箱中保存。

1.2.5 抑菌实验 用灭过菌的打孔器在涂布菌液的平皿上边缘处每旋转120°打一个孔，培养皿中心部分打一个孔，95%乙醇粗提物以DMSO试剂作为空白对照，蒸馏水粗提物以无菌水作为空白对照。从培养皿的正下方，用无菌移液枪顺时针分别加入0.1mL浓度分别为500.00、100.00、20.00mg/mL的生药。每种菌平行做3个培养皿实验。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和四联球菌在37℃恒温箱培养24h，荧光假单胞菌在28℃恒温箱培养24h观察有无抑菌圈。

1.2.6 最低抑菌浓度(MIC)的测试 在上述3种浓度梯度抑菌实验的基础上采用打孔法测试宣木瓜95%乙醇粗提物和宣木瓜蒸馏水粗提物对5种有害菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度。每种菌、每个皿用无菌打孔器每旋转60°打一个孔，每皿共打6个孔，中央的孔作为空白对照，其中宣木瓜95%乙醇粗提物以DMSO溶剂作为对照，宣木瓜蒸馏水粗提物以无菌蒸馏水作为对照。将两种宣木瓜粗提物采用二倍稀释法进行稀释，每种菌的每种浓度的不同粗提物做3个平行，以其平均值作为抑菌结果。

1.2.7 最低杀菌浓度(MBC)的测试 待测定完最低抑菌浓度后，继续将各皿培养24h，以有抑菌圈出现的最低生药浓度为此药液对此细菌的最低杀菌浓度(MBC)。

1.2.8 提取物稳定性研究

1.2.8.1 紫外光稳定性测定 每个皿用无菌打孔器均匀打5个孔，将浓度为100.00mg/mL的宣木瓜粗提物置于紫外光下分别照射5、10、15、20、25min，顺时针每孔加入同浓度不同处理时间的药液，中央的孔加入不经过紫外光处理的同浓度同体积的药液作为对照，平行实验做3组。分别以荧光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和四联球菌为指示菌，用十字交叉法测定其抑菌圈直径，实验重复3次。

1.2.8.2 热稳定测定 每个皿用无菌打孔器均匀打5个孔，将浓度为100.00mg/mL的宣木瓜粗提物分别置于40、60、80、100、121℃湿热条件下各处理20min，对照置于常温条件下。待冷却到常温条件下时，顺时针每孔加入同浓度不同处理温度的药液，中央的孔加入不经过热处理的同浓度同体积的药液作为对照，平行做实验3组。分别以荧光假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌和四联球菌为指示菌，用十字交叉法测定其抑菌圈直径，实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 宣木瓜粗提物对细菌的抑制作用

由表1可知，95%乙醇粗提物和蒸馏水粗提物均对荧光假单胞菌有抑制作用，其中乙醇粗提物对荧光假单胞菌的抑菌活性高于蒸馏水粗提物。蒸馏水粗提物浓度降低到为20.00mg/mL时，对荧光假单胞菌无抑制作用。95%乙醇粗提物和蒸馏水粗提物均对大肠杆菌有抑制作用，但是浓度为100.00mg/mL时，抑菌圈内有零星的菌落生长，总体来看抑菌效果一般，乙醇粗提物的抑制作用优于蒸馏水粗提物。95%乙醇粗提物和蒸馏水粗提物均对枯草芽孢杆菌有抑制作用，浓度为100.00mg/mL时，抑菌圈内有也有零星的菌落生长，抑菌效果不佳，由抑菌圈的数据来看，两者抑菌作用很接近。95%乙醇粗提物和蒸馏水粗提物对金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用，其中乙醇粗提物的抑菌作用略高于蒸馏水粗提物。95%乙醇粗提物和蒸馏水粗提物均对四联球菌表现出了很强的抑制作用，乙醇粗提物对四联球菌的抑制作用高于蒸馏水粗提物。

表1 宣木瓜95%乙醇粗提物和蒸馏水粗提物对5种细菌的抑制作用

表2 宣木瓜95%乙醇粗提物对5种细菌的最低抑菌浓度(MIC)

表3 宣木瓜95%乙醇粗提物对5种细菌的最低杀菌浓度(MBC)

2.2 宣木瓜粗提物对细菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度

2.2.1 乙醇粗提物的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度由表2和表3可知，宣木瓜95%乙醇粗提物对荧光假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和四联球菌均有不同程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为15.63mg/mL，是抑制这5种细菌中所需最高的生药浓度;对荧光假单胞菌的最低抑菌浓度为0.98mg/mL，是抑制这5种细菌中所需最低的生药浓度。继续将各皿培养24h后，抑菌作用都有不同程度的降低，表现为各皿中抑菌圈变小或者某浓度下抑菌圈消失。可见抑菌作用是随着时间的延长而有所降低。

2.2.2 蒸馏水粗提物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC) 由表4和表5可知，对荧光假单胞菌的最低抑菌浓度为62.50mg/mL，是抑制这5种细菌中所需生药最高的浓度。对其余4种菌的最低抑菌浓度维持在15.63mg/mL左右。继续将各皿培养24h后，金黄色葡萄球菌在最低抑菌浓度下的抑菌圈消失，一直在浓度达到62.50mg/mL时，抑菌圈才出现，和荧光假单胞菌的最低杀菌浓度均为62.50mg/mL。与95%乙醇粗提物相比，蒸馏水粗提物的抑菌作用随着时间的延长变化不大。

2.3 紫外光和温度处理对粗提物抑菌作用的影响

2.3.1 紫外光对粗提物抑菌作用的影响 用无菌移液枪顺时针分别加入经紫外光分别处理5、10、15、20、25min的浓度为100mg/mL生药0.1mL，中间的孔加入不做任何紫外光处理的同浓度同体积的生药作为对照。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、四联球菌的培养皿在37℃恒温培养箱培养24h，荧光假单胞菌在28℃恒温培养箱培养24h，测定其抑菌圈直径。取3次抑菌圈直径的平均值。

表4 宣木瓜蒸馏水粗提物对5种细菌的最低抑菌浓度(MIC)

表5 宣木瓜蒸馏水粗提物对5种细菌的最低杀菌浓度(MBC)

表6 紫外光照射对95%乙醇粗提物对5种细菌抑制作用的影响

由表6和表7可知，随着紫外光处理时间的变化，乙醇粗提物和蒸馏水粗提物的抑菌活性基本保持不变，由此可见宣木瓜乙醇粗提物和蒸馏水粗提物对紫外光具有极高的稳定性。

表7 紫外光照射对蒸馏水粗提物对5种细菌抑制作用的影响

2.3.2 温度对宣木瓜粗提物的抑菌作用影响 用无菌移液枪顺时针分别加入经热处理温度分别为40、60、80、100、121℃的100mg/mL的生药0.1mL(待冷却到常温)，中间的孔加入不做任何热处理的同浓度同体积的生药作为对照。将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、四联球菌的培养皿在37℃恒温培养箱培养24h，荧光假单胞菌在28℃恒温培养箱培养24h，测其抑菌圈直径。取3次抑菌圈直径的平均值。

由表8和表9可知，乙醇粗提物和蒸馏水粗提物经不同温度处理后其抑菌活性差别不大，基本保持原有的抑菌活性，即使在121℃处理20min后仍具有较高的活性。表明宣木瓜粗提物的抑菌活性具有较好的热稳定性。

表8 温度对95%乙醇粗提物对5种细菌抑制作用的影响

表9 温度对蒸馏水粗提物对5种细菌抑制作用的影响

2.4 宣木瓜中抑菌成分探讨

从抑菌的实验结果来看，宣木瓜的两种粗提物对细菌有广谱抑制作用，抑菌作用应该是宣木瓜中的抑菌物质综合作用的结果。宣木瓜中含有的有机酸尤其是齐墩果酸、单宁、黄酮类等物质都是粗提物可能对细菌产生抑制作用的物质。

齐墩果酸是木瓜主要药效成分之一，以单体或皂甙形式存在，国内外研究证实，齐墩果酸具有消炎抑菌、降转氨酶、降糖、降血脂、抗血栓形成、抗突变、抗爱滋病、抑制HIV－1的复制等作用［7］。

有关资料表明，黄酮类化合物具有显著的抗氧化及抗自由基、抗癌及防癌、降压及降血脂、改善微循环、抑菌、消炎等功能［4］。

单宁对微生物具有广谱抗性(包括对丝状真菌、酵母、细菌、病毒的抑制)。以单体为主体的植物多酚不仅抵御食草动物对植物体的损害，同时也阻止了微生物的侵袭，包括提高对各种致病菌的耐受力和保护受伤部位。除了对植物致病菌外，单宁对动物体内和其他环境中多种微生物的生长都有明显的抑制作用［8］。

综上所述，宣木瓜粗提物对细菌有抑制作用，是上述多种成分共同抑制的结果，并不是单一成分在起作用。由于提取溶剂95%乙醇和蒸馏水，提取出来的抑菌成分在比例和量的方面有所不同，这或许是乙醇粗提物和蒸馏水粗提物对细菌的抑制作用不同的原因。

3 结论

宣木瓜乙醇粗提物和蒸馏水粗提物对细菌有广谱抗菌作用，既对革兰氏阴性菌(荧光假单胞菌和大肠杆菌)有抑制作用，也对革兰氏阳性菌(枯草杆菌、金黄色葡萄球菌和四联球菌)有抑制作用，既有球菌如:金黄色葡萄球菌和四联球菌，也有杆菌如:枯草杆菌、大肠杆菌和荧光假单胞菌。从同浓度抑菌实验来看，95%乙醇粗提物对5种有害菌的抑菌强弱顺序为:四联球菌＞金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌＞荧光假单胞菌;蒸馏水粗提物对5种有害菌的抑菌强弱顺序为:四联球菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草杆菌＞荧光假单胞菌;且95%乙醇粗提物的抑菌活性普遍高于蒸馏水粗提物。

宣木瓜95%乙醇粗提物对5种细菌的MIC范围为:0.98～15.63mg/mL，MBC范围为:3.91～31.25mg/mL;蒸馏水粗提物的 MIC和 MBC范围均为15.63～62.50mg/mL。

宣木瓜粗提物的抑菌作用是宣木瓜中多种抑菌成分综合作用的结果，并非单一成分的作用，可能与其中含有的齐墩果酸、黄酮类化合物、酚类等成分有关。粗提物的紫外光稳定性和热稳定性好，温度甚至达到121℃仍能保持较高的抑菌活性。从抑菌效果来看，宣木瓜粗提物具有被开发为天然防腐剂的潜力。至于宣木瓜中具体是哪些物质在起抑菌作用以及抑菌机理如何，有待于进一步研究。

［1］张超，陈奉玲，汤兴毫.木瓜的本草考证［J］.中草药，1999，30(12):943.

［2］吴延廷，张俊.中药木瓜的基源和性状鉴定［J］.华西医科大学学报，1996，27(4):404－408.

［3］周根土.宣木瓜丰产栽培技术经济林研究［J］.2003，21 (4):85－86.

［4］唐春红，叶志义，项昭保，等.木瓜营养保健作用研究动态［J］.天然产物研究与开发，2000，12(4):97－100.

［5］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典一部［M］.北京:化学工业出版社，2000:45.

［6］张文治.新编食品微生物学［M］.北京:中国轻工业出版社，2001:379.

［7］Kashiwad Y，Wang H K，Nagao T，et al.Anti－AIDS agents 30 Anti－HIV activity of oleano lic acid，pomolic acid，and structrally related triterpeno ides［J］.J Nat Prod，1998，61(9):1090－1095.

［8］石碧，狄莹.植物多酚［M］.北京:科学出版社，2000:118.

Study on the antimicrobial activity of Chaenomeles Speciosa S.Nakai

WANG Xu－dong，DONG Ming*，LI Na，ZHANG Guo－qing，YU Ya－qiong
(College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)

Chaenomeles Speciosa S.Nakai was extracted by bain－marie vibration method with 95%ethanol and distilled water as solvent in order to study the antimicrobial activity of its crude extracts and the influence of ultraviolet ray and temperature on their antimicrobial activities.Two different crude extracts were tested the antimicrobial activity to Pseudomonas fluorescens，Escherichia coli，Bacillus subtilis，Staphylocaccus aureus，Micrococcus tetragenus and minimum inhibitory concentration and minimal bactericidal concentration by disk diffused tests.The results showed that 95%ethanol crude extract and distilled water extract possessed obvious antimicrobial activity to five harmful bacterias，and 95%ethanol crude extract of antimicrobial activity was superior than that of distilled water extract，crude extracts both had good ultraviolet stabilization and thermo stabilization. Key words:Chaenomeles Speciosa(Sweet)Nakai;ethanol crude extract;distilled water crude extract;antimicrobial activity;disk diffused tests

TS255.1

A

1002－0306(2011)12－0175－05

宣木瓜，安徽著名特产，因产于安徽省宣城市而得名，是药用木瓜的正品［1－2］。国家卫生部第一批“药食同源”名单中公布:宣木瓜既是药品，又是食品。学名为贴梗海棠(Chaenomeles Speciosa(Sweet) Nakai)，又名皱皮木瓜、铁脚梨，属蔷薇科木瓜属，落叶阔叶灌木。宣木瓜与“甘枸杞”、“川杜仲”、“藏红花”并称为我国的四大名产中药材［3］。关于宣木瓜的研究集中在医疗作用［4］和栽培技术［3］领域。研究表明，宣木瓜果实富含有机酸、皂甙、维生素、胡萝卜素、氨基酸、果胶、黄酮类和钾、镁、钙、锌、铁、锰、磷等多种微量元素和营养物质，具有极高的食用价值和营养保健作用［4］。李时珍在《本草纲目》中记载:“木瓜处处有之，而宣城者为佳。”木瓜作为一种常用中药，味酸、温、入肝、脾经，有平肝舒筋、和胃化湿之功效［5］。鉴于宣木瓜中含有很多活性物质，本实验采用水浴振荡法分别以95%乙醇和蒸馏水为溶剂对宣木瓜进行提取得到粗提物，通过平板打孔法测定宣木瓜乙醇粗提物和蒸馏水粗提物对食品中的有害菌:荧光假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和四联球菌的抑菌效果，并测定它们各自对每种有害菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度，以期为把宣木瓜粗提物开发成食品的天然防腐剂提供理论依据。

2010－11－03 *通讯联系人

王旭东(1985－)，男，硕士研究生，研究方向:植物源食品质量与安全。