沙枣不同果、叶中多酚类物质抗氧化能力比较的研究

刘丹丹，李炳奇，陈韩英，童德军，刘 红，*

(1.石河子大学化学化工学院，新疆石河子832003; 2.石河子大学药学院，新疆石河子832003; 3.石河子大学师范学院，新疆石河子832003)

沙枣不同果、叶中多酚类物质抗氧化能力比较的研究

刘丹丹1，李炳奇1，陈韩英2，童德军3，刘 红1，*

(1.石河子大学化学化工学院，新疆石河子832003; 2.石河子大学药学院，新疆石河子832003; 3.石河子大学师范学院，新疆石河子832003)

采用丙酮温浸法对尖果沙枣和大果沙枣果、叶中多酚物质进行提取并研究其抗氧化活性。通过测定不同材料多酚提取物对羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(·)以及2，2二苯代苦味肼基(DPPH·)的清除率，并利用硫代巴比妥酸法(TBA法)测定其对脂质过氧化的抑制作用。结果表明:八种实验材料中，尖果沙枣青果和嫩叶多酚提取物对·OH·、DPPH·均具有较好的清除作用，且清除率均高于50%，同时对脂质过氧化的抑制作用明显高于其余实验材料。尖果沙枣较大果沙枣具有更好的体外抗氧化活性。

沙枣，多酚，自由基，抗氧化活性，TBA法

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

尖果沙枣(Elaeagnus oxcarpa Schlecht.)和大果沙枣(Elaeagnus moorcroftii Wall ex Schlecht.)的青果、熟果、嫩叶、老叶 以上材料均采于野外，经生命科学学院阎平教授鉴定;丙酮、无水碳酸钠、没食子酸、Folin－酚、无水乙醇、Tris－HCl缓冲溶(pH=8.2)、邻苯三酚、PBS磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)、硫酸亚铁、邻二氮菲、双氧水、亚油酸、三氯乙酸、正丁醇、硫代巴比妥酸 以上所用试剂均为国产分析纯; DPPH Sigma公司。

R－200旋转蒸发器 瑞士BUCHI;SHZ－CB循环水真空泵 河南巩义市英峪予华仪器厂;BS210电子天平 德国Sartorius公司;UV－2401PC型紫外分光光度计 日本岛津公司;80－2低速台式离心机江苏省金坛市医疗仪器厂;B－260恒温水浴锅 上海安亭实验仪器有限公司;DNP－5092电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 沙枣多酚含量的测定 多酚含量的测定采用福林－酚比色法(Folin－Ciocalteau)。准确称取真空干燥至恒重的没食子酸标准品44.3mg置于100mL棕色容量瓶中，用水溶解并定容至100mL，摇匀，作为对照品溶液。将配制好的没食子酸溶液配成浓度为4.43、8.86、17.72、35.44、70.88、88.60μg/mL的溶液。分别取上述不同浓度溶液1mL加到10mL容量瓶中，然后依次加入1mL去离子水，0.5mL 2mol/L Folin－酚试剂溶液，1.5mL 26.7%Na2CO3溶液，用水定容至10mL。室温下反应2h，在760nm下测定吸光度。由吸光度对浓度进行线性回归，得方程:C= 88.438A－2.926，相关系数R2=0.9993。样品中多酚含量按下式计算:

式中:P－多酚含量(%);C－由回归方程中计算出的多酚的浓度(μg/mL);V－多酚提取液的总体积(mL);n－稀释倍数;W－沙枣样品质量(g)。

1.2.2 沙枣多酚的提取 称取干燥沙枣粉末50g，以1∶10的料液比加入50%的丙酮浸泡24h后过滤，滤液减压浓缩除去丙酮得到沙枣多酚提取物。

1.2.3 沙枣多酚清除自由基实验

1.2.3.1 清除羟基自由基的能力［4］根据Fenton反应原理产生·OH，羟自由基可以将邻二氮菲－Fe2+氧化为邻二氮菲－Fe3+，使邻二氮菲－Fe2+在536nm处的最大吸收峰消失。根据536nm处吸光度的变化情况判断受试物清除·OH的能力。

精确量取5.0mL PBS磷酸盐缓冲溶液(pH= 7.4，下同)置于25mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀作空白;精确量取5.0mL PBS、1.0mL邻二氮菲(7.5mmol/L，下同)、1.0mL FeSO4(7.5mmol/L，下同)于25mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀作为未损伤管;精确量取5.0mL PBS、1.0mL邻二氮菲、1.0mL FeSO4、1.0mL H2O2(0.1%)置于25mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀作为损伤管。精确量取5.0mL PBS，1.0mL沙枣多酚提取液置于25mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀作为样品参比管。精确量取5.0mL PBS、1.0mL邻二氮菲、1.0mL FeSO4、1.0mL沙枣多酚提取液和1.0mL H2O2置于25mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，混匀作为样品管。将上述容量瓶均置于黑暗处，放置1h，在536nm处测吸光度(A)值，每处理重复3次，用其平均值按下式计算羟自由基清除率:

羟自由基清除率(%)=(A样品－A损伤)/(A未损－A损伤)×100%

1.2.3.2 清除超氧阴离子自由基的能力［5］邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，自氧化过程中产生··可加快邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30～45s时，与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢。有色产物在325nm有强烈的光吸收。

精确量取Tris－HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH= 8.2)4.5mL和0.1mL沙枣多酚提取液置于试管中，混匀后在室温下放置4min，然后于325nm处测定样品吸光度B值。精确量取Tris－HCl缓冲溶液4.5mL和3mL邻苯三酚(7mmol/L)，立即开始计时，于325nm处每隔30s测其吸光度A0值，共记录3min。依上法，精确量取Tris－HCl缓冲溶液4.5mL和0.1mL沙枣多酚提取液，混匀后在室温下放置4min，立即加入3mL邻苯三酚并开始计时，于325nm处每隔30s测样品与邻苯三酚反应后的吸光度A值，共记录3min;此实验重复三次，求其平均值。空白管用10mmol/L HCl代替3mL邻苯三酚。用每组平均值按下式计算超氧阴离子自由基清除率:

式中:A0－未加样的邻苯三酚的吸光度;A－样品与邻苯三酚反应后的吸光度;B－样品的吸光度。

1.2.3.3 清除DPPH自由基的能力［6］DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，由于DPPH自由基有一个单电子并在517nm处有强的吸收，其乙醇溶液呈深紫色，如果有其他物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收将会消失，褪色程度与其接受的电子呈定量关系。

取2mL沙枣多酚提取液及2×10－4mol/L DPPH溶液2mL加入同一具塞试管中，摇匀。30min后测定其在517nm处的吸光度 Ai，同时测定2mL 2× 10－4mol/L DPPH溶液与2mL无水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2mL沙枣多酚提取液与2mL无水乙醇混合液的吸光度Aj。根据下列公式计算沙枣多酚对DPPH自由基的清除率:

式中:Ac－未加抗氧化剂时DPPH溶液的吸光度;Ai－加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度;Aj－抗氧化剂在测定波长的吸光度。

1.2.3.4 TBA法测定多酚抗氧化能力［7］硫代巴比妥酸(TBA)法是目前测定脂质过氧化最传统也是应用最多的方法。脂质中的高不饱和脂肪酸被氧化为过氧化脂质，后期生成大量的丙二醛(MDA)，其可与TBA缩合，在pH 3.0条件下显粉红色，此粉红色物质在532nm处有特征吸收，可根据吸光度值A判断脂质过氧化的程度。

分别加入相同浓度不同材料的多酚提取液、VC(mg/mL)和蒸馏水4mL置于具塞锥形瓶中，依次加4.1mL2.5%亚油酸溶液，8mL 0.05mol/L PBS(pH7.4)缓冲溶液，3.9mL去离子水，以无水乙醇作为基础对照。混匀后置于40℃培养箱中避光培养。每隔24h取样1mL，加入20%三氯乙酸1mL，静置20min加入2mL 0.3%硫代巴比妥酸溶液，混匀后沸水浴加热20min，室温下冷却后加入4mL正丁醇，充分摇匀，于3000r/min离心15min，取上清液于532nm测定样品吸光度A。

2 结果与分析

2.1 尖果沙枣与大果沙枣不同果、叶中多酚物质对三种自由基的清除作用

由表1可以看出，尖果沙枣和大果沙枣的青果、熟果多酚提取物对羟自由基、超氧阴离子自由基以及DPPH自由基均具有一定的清除作用，且清除率均高于50%。其中尖果沙枣青果、熟果多酚提取物对三种自由基的清除能力高于大果沙枣青果和熟果，而尖果沙枣青果多酚提取物对三种自由基的清除能力又大于熟果。因此，尖果沙枣青果多酚提取物对三种自由基具有较好的清除效果。

表1 不同沙枣果中多酚物质对三种自由基的清除率(%)

从表2可知，尖果沙枣和大果沙枣的嫩叶、老叶多酚提取物对三种自由基具有不同程度的清除作用。尖果沙枣嫩叶、老叶多酚提取物对羟自由基以及超氧阴离子自由基的清除能力高于大果沙枣嫩叶和老叶，尖果沙枣以及大果沙枣嫩叶、老叶多酚提取物对DPPH·的清除能力差异不明显。

表2 不同沙枣叶中多酚物质对三种自由基的清除率(%)

2.2 尖果沙枣与大果沙枣不同果、叶中多酚物质对脂质过氧化的抑制作用

由图1可知，四种材料的多酚提取物均可有效地防止脂质过氧化作用。在第10d，亚油酸氧化达到最大值，同一时段尖果沙枣青果多酚提取物比尖果沙枣熟果以及大果沙枣青果、熟果所测得的吸光度A值都小，表明其对脂质过氧化的阻断作用最强，且其效果明显优于同浓度的VC。随后由于生成的丙二醛量减少，A值下降。

图1 不同沙枣果中多酚物质对亚油酸的抗氧化作用

尖果沙枣以及大果沙枣叶中多酚提取物对脂质过氧化的阻断趋势与果实的趋势相似。实验结果见图2，从图2中可看出尖果沙枣嫩叶多酚提取物与其老叶以及大果沙枣嫩叶、老叶相比，能更有效地防止脂质过氧化作用。

图2 不同沙枣叶中多酚物质对亚油酸的抗氧化作用

3 结论

本实验研究了尖果沙枣和大果沙枣的青果、熟果、嫩叶、老叶中多酚提取物对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除能力以及对脂质过氧化作用的抑制作用。研究表明，尖果沙枣青果以及嫩叶多酚提取物相对于其余6种实验材料具有较好的抗氧化活性，而且尖果沙枣在新疆分布较广、资源丰富、价廉易得，因此，将其研究开发为抗氧化产品，具有很好的应用前景。

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Study on comparing the antioxidant capacity of angustifolia polyphenol in different fruits and leaves

LIU Dan－dan1，LI Bing－qi1，CHEN Han－ying2，TONG De－jun3，LIU Hong1，*
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Shihezi University，Shihezi 832003，China; 2.College of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832003，China; 3.Normal College，Shihezi University，Shihezi 832003，China)

The polyphenol in fruits and leaves from Elaeagnus oxcarpa and Elaeagnus moorcroftii was extracted by using acetone，and the antioxidant activities were studied.The scavenging capacities of polyphenol in different materials on hydroxyl free radical，superoxide anion radical and 2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl were assayed. Meanwhile，the inhibition effect of lipid peroxidation was studied with thiobarbituric acid(TBA)method.The results showed that the polyphenol in green fruit and tender leaf of Elaeagnus oxcarpa had better scavenging capacity on ·OH，O2－·and DPPH·during 8 kinds of material，moreover，the scavenging ratio was above 50%，respectively. And the inhibition effect of lipid peroxidation was higher than other material obviously.Elaeagnus oxcarpa had better antioxidant activities than Elaeagnus moorcroftii in vitro.

angustifolia;polyphenol;free radicals;antioxidant activity;thiobarbituric acid method

TS255.1

A

1002－0306(2011)12－0093－03

沙枣主要分布在我国的西北各省区和内蒙古西部，沙枣果、叶中的多酚类物质含量十分丰富［1］。多酚类物质是从天然植物中发现的一类重要的抗氧化活性成分，具有抗氧化、抗龋齿、抗菌、抑制胆固醇上升、消除活性氧、抑制癌症发生等作用［2－3］。新疆沙枣的分布面积广、产量高、价格便宜，本实验从测定活性氧清除率、DPPH自由基清除率以及对脂自由基的抑制作用方面进行研究，探讨沙枣多酚的抗氧化活性，对充分利用本地资源，开发出更多更好的天然抗氧化剂，具有重要的现实意义。

2010－11－19 *通讯联系人

刘丹丹(1986－)，男，在读硕士研究生，研究方向:天然产物的研究与开发。

教育部“春晖计划”项目(Z2006－1－83003)。