铈代替铅电镜酶组织化学显示培养脊神经节神经元 TMP活性

2011-11-02刘冬娟徐彦平石玉秀

中国组织化学与细胞化学杂志 2011年1期

关键词：电镜胞质溶酶体

刘冬娟徐彦平石玉秀

(中国医科大学基础医学院电子显微学研究室,沈阳 110001)

铈代替铅电镜酶组织化学显示培养脊神经节神经元 TMP活性

刘冬娟徐彦平石玉秀＊

(中国医科大学基础医学院电子显微学研究室,沈阳 110001)

目的探讨铈法显示脊神经节神经元初代培养细胞的 TMP(三偏磷酸酶)活性。方法应用电镜酶组化技术,以铈作为捕捉剂代替常规以铅作为捕捉剂来检测观察脊神经节初代培养的神经元内溶酶体的 TMP活性。结果脊神经节神经元初代培养细胞内存在 TMP阳性的溶酶体,其 TMP阳性反应颗粒较常规以铅作为捕捉剂来显示溶酶体不仅孵育液充分溶解呈清亮透明,电镜下反应产物颗粒也微细均匀,而且避免了反应产物的扩散及非特异性沉淀。结论以铈作为捕捉剂来检测溶酶体的 TMP活性用于电镜下观察,其方法稳定、易行,是一种能很好显示溶酶体标记酶的电镜酶组化技术方法。

铈; 脊神经节; 神经元; 三偏磷酸酶; 电镜组织化学

酶组织化学具有将形态学、生化学或生理学联系起来的独特特点,在医学生物学领域日益发挥着重要的作用。它是利用酶化学反应的产物,在显微镜下被识别,借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在和部位[1]。目前在细胞超微结构水平上能够定位的酶约有80多种,用铅法检测酶的活性还是比较常用的方法。而用钡、钴、锶及铈代替铅的方法也有报告[1],并且应用在检测部分酶的活性上。三偏磷酸酶 (thiamine monophosphatase,TMP)作为溶酶体的标志酶,是溶酶体的蛋白水解酶[2],其活性变化直接体现溶酶体的功能状态[3]。铈法能否在脊神经节神经元初代培养细胞中检测出溶酶体的TMP活性?目前还未见报道。本实验应用电镜酶组化技术,以铈作为捕捉剂来检测观察脊神经节神经元初代培养细胞内溶酶体的 TMP活性,以及溶酶体的形态和分布,进而为应用电镜酶组化技术,研究溶酶体的细胞生物学特性提供新的方法。

材料和方法

1.实验动物和细胞培养

实验动物选用由中国医科大学动物中心提供出生12h内的 Wistar大鼠,雌雄兼用。取胎鼠4只,超净台下无菌操作,摘取脊神经节浸泡于 Hanks液中,剪碎脊神经节至1mm3大小,吸入离心管中;加入20-30倍的0.25%胰酶37℃下消化30min;加入胎牛血清 1滴终止消化,1000rpm/min离心10min;弃上清加入DMEM 至 10ml,吹打过滤,滤液为脊神经节神经元的单细胞悬液。用台盼蓝拒染法测定所得细胞活性后,将细胞悬液浓度调整为1×106个/ml,种植在经多聚赖氨酸处理过的内置ACLAR膜(聚苯乙烯薄膜)的6孔培养板内,每孔2ml,37℃下5%CO2的CO2培养箱中孵育;48h后每孔用DMEM 1/2量换液,即换入DMEM 1ml,同时每孔加入阿糖胞苷16μg,以抑制非神经元的过度增殖。然后每2d换液1次,每孔换2/3量的DMEM。

2.TMP染色及电镜标本制备

将培养7d的使用聚苯乙烯薄膜(ACLAR)细胞观察存活后从培养孔内取出,用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液(PH7.4)配制含4%多聚甲醛和0.25%戊二醛的固定液固定1h,经0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗1h。置于下述孵育液中,孵育液配方:0.05mol/L 醋酸缓冲液 20ml(p H3.9)、氯化铈35.405mg(用 4 ml DH2O 调制)、三偏磷酸酶15.29g、蔗糖 2.5g、TritonX-100 0.000075 ml、DH2O 26 ml、总量为 50 ml最终 p H3.9,室温孵育 80 min。对照组则加入去除底物三偏磷酸酶的反应液,同样反应。用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗2次,经1%锇酸固定30 min,酒精、丙酮梯度脱水,Epon812浸透并在ACLAR膜上原位倒扣包埋,聚合后剥离ACLAR膜,在解剖显微镜下进行脊神经节神经元定位、修块,超薄切片厚度70nm,经醋酸铀染色,J EM-1200EX透射电镜下观察、拍片。

结果

透射电镜下TMP阳性反应产物为高电子密度的黑色磷酸铈盐细小颗粒沉淀,分布于脊神经节神经元胞质内的圆形溶酶体和线状溶酶体上。TMP反应产物颗粒均匀、微细,末见扩散及非特异性沉淀(图1),细胞核呈阴性。而用铅作捕捉剂显示脊神经节神经元胞质内溶酶体的 TMP活性阳性反应产物颗粒较粗大(图2),并见有非特异反应产物的遮隐,有的核被染色。对照组脊神经节神经元胞质溶酶体上未见 TMP活性阳性反应物颗粒,呈阴性反应(图 3)。

讨论

酶组织细胞化学技术是通过酶的特异组织化学反应显示酶在细胞内定位,它已成为细胞的物质交换、神经传导、信息传递、能量转换、激素作用、细胞识别、免疫、药物治疗、癌变机理等方面分子水平上结构和功能研究的重要手段之一。在电镜水平上显示酶的组织化学方法都是以孵育阶段为中心,在所有的水解酶组织化学技术中,孵育液中都含有酶的底物和捕捉剂。常用的捕捉剂有铅、钴等,Saito等、Rechardt和 Hervonen报告了用铈作为捕捉剂的检测方法[1],并且已经用在了检测5-核苷酸的活性上。显示磷酸酶的捕捉因子,一直常用铅盐,但它有孵育液配制易混浊或非特异性染色等缺点,会使酶活性的确认发生困难。为了改善这种状况,我们尝试用氯化铈代替了铅盐作为捕捉剂,在 TMP酶活性检测上,获得了很好的效果。TMP是溶酶体的蛋白水解酶[2],可用来显示溶酶体。

溶酶体是一种形态可变的细胞器,内含70多种水解酶,在细胞内可以移动、变形,参与细胞的自身吞噬和异体吞噬,是细胞的消化器[4]。1973年Backley[5]首先发现呈酸性磷酸酶阳性的管状结构沿细胞的边缘存在,称其为线状溶酶体。溶酶体的存在有两种形式,即线状溶酶体(nematolysosome,NL Y)和圆形溶酶体(spherical lysosome,SL Y)[6]。NL Y和SL Y的形态可以相互转换,共同参与细胞的物质转运。用 TMP来显示溶酶体,其组织化学反应原理为:TMP以三偏磷酸钠为水解底物,在p H4左右的条件下三偏磷酸钠被 TMP水解并释放出磷酸,后者与捕捉剂氯化铈的Ce3+直接捕获形成CePO4沉淀,既最终反应产物。将孵育液中的Pb2+换成Ce3+,其孵育液比较稳定,不会出现混浊现象,结果在脊神经节神经元初代培养细胞的线状溶酶体和圆形溶酶体上,得到了均匀的富有连续性的 TMP反应产物。其 TMP阳性反应产物为呈高电子密度的微细颗粒,而且反应产物的扩散及非特异性沉淀都极少。

以铈作为捕捉剂来检测溶酶体的 TMP活性用于电镜下观察,不仅提高了检测的敏感性,还能比较准确地判定其活性部位。其方法稳定、易行,是一种能很好显示溶酶体标记酶的电镜酶组化技术方法。与用铅作捕捉剂显示TMP活性相比较阳性反应产物更为微细,同时也减少了非特异反应产物的遮隐,很少有核染色。值得注意的是在配制孵育液时,首先所用器皿一定要双蒸水冲洗洁净,试剂要按顺序依次加入,必须在前一种完全溶解后方可加入第二种,这样配制的孵育液最终能清彻透明,短暂放置亦不会变混浊。

[1]小川和郎,中根一穗.酶组织细胞化学技术,上海,上海医科大学出版社,1989:1-153

[2]Doty S B,Smith C E,Hand AR,et al.Inorganic trimetaphosphatase as a histochemical marker for lysosomes in light and electron microscopy.J Histochem Cytochem,1977,25(12):1381-1384

[3]丁春兰,韩芳,石玉秀.创伤后应激障碍大鼠杏仁核神经元凋亡及三偏磷酸酶活性的变化.解剖学杂志,2009,32(1):19-22

[4]沈雪莉,商秀丽,石玉秀.神经干细胞定向分化过程中溶酶体表达变化的研究.中国组织化学与细胞化学杂志,2007,16(6):691-694

[5]Backley IK.The lysosome of cultured chick embryo cells:a correlated light and electron microscopic study.Lab Invest,1973,29(4):411-421

[6]王春芳,石玉秀,荣明.电镜观察脊髓神经元溶酶体的形态及影响因素.解剖科学进展,2003,9(2):109-112

图版说明

图1 铈法显示培养脊神经节神经元胞质内的溶酶体 TMP呈阳性分布反应产物颗粒均匀、微细,细胞核呈阴性。×18000

图2 铅法显示培养脊神经节神经元胞质内的溶酶体 TMP呈阳性分布反应产物颗粒较粗大,胞质内有扩散的颗粒。×18000

图3 对照组培养脊神经节神经元胞质内的溶酶体 TMP呈阴性反应。×12000

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Cerium method showed in the lysosomes of the spinal ganglion cell fine and homogenously distributed TMP positive reaction particles,the nucleaus(Nu)was negative. ×18500

Fig.2 Lead method showed in the lysosomes of the spinal ganglion cell relatively rough TMP positive particles,there was also diffusion in the cytoplasma. ×18000

Fig.3 In the control group,the the lysosomes of the spinal ganglion cell were TMP negative. ×12000

Etectron microscopic enzyme histochemistry using cerium as a substitule for lead to demonstrate TMP activity in the spinal ganglionic neurons

Liu Dongjuan,Xu Yanping,Shi Yuxiu＊

(Department ofElectron Microscopy,China Medical University,S henyang110001,China)

Objective To investigate the cerium method showing the TMP(thiamine monophosphatase)positive neurons in the primative culture of spinal ganglion cells.Methods Applying electron microscopic histochemistry,we used cerium instead of conventional lead as the capture agent to detect the TMP activity in the lysosome of cultured ganglion neurons.Results In the spinal ganglion cells,lysosomes were positively stained with TMP. The novel cerium agent was completely soluable in the culture medium.The particles under the microscope were also finer and more uniform than the conventional lead product.This indicated that by using the new cerium agent,diffusion and unspecific precipitation was avoided in the experiment.Conclusion Using cerium as the capture agents to detect lysosomal TMP activity under electron microscopy is a stable and feasible method,with is a better histochemical way for the demonstration of lysosomal enzyme activity than the conventional lead.

Cerium; Cerebrospinal ganglia; Neuron; Thiamine monophosphatase; Electron microscopic histochemistry