VEGF-α诱导对卵巢癌血管生成拟态形成及侵袭、迁移能力的影响

王俊艳 王 立 孙 涛赵秀兰赵 楠孙保存＊

(天津医科大学组织学与胚胎学教研室;1天津医科大学病理学教研室,天津 300070)

VEGF-α诱导对卵巢癌血管生成拟态形成及侵袭、迁移能力的影响

王俊艳 王 立 孙 涛1赵秀兰1赵 楠1孙保存1＊

(天津医科大学组织学与胚胎学教研室;1天津医科大学病理学教研室,天津 300070)

目的 探讨细胞因子VEGF-α诱导对卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞系血管生成拟态形成及侵袭、迁移能力的影响。方法 采用不同细胞因子诱导卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞系,通过三维培养来观察卵巢癌细胞形成血管生成拟态的能力;以划痕实验和侵袭实验来判断细胞因子诱导对卵巢癌细胞侵袭、迁移能力的影响。结果 三维培养结果表明在VEGF-α组SKOV-3和OVCAR-3细胞可观察到大量、明显的血管样网状结构;细胞划痕试验结果表明卵巢癌细胞系经细胞因子诱导后,其迁移能力明显增强;体外侵袭实验表明VEGF-α能够明显增强卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞的体外侵袭能力。结论 VEGF-α能促进卵巢癌细胞系血管生成拟态的形成,并明显增强卵巢癌细胞侵袭和迁移的能力。

VEGF-α; 卵巢癌; 血管生成拟态; 侵袭; 迁移

血管生成是影响实体瘤生长和转移的重要因素,血管生成过程受多种因子调控,大量研究证实,血管内皮生长因子及血管内皮生长因子受体(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,VEGFR)在肿瘤血管生成中起重要作用,被认为是迄今为止最重要的促血管生成因子[1]。最近研究表明卵巢癌组织中的VEGF阳性表达以及卵巢癌患者血清标本中VEGF的含量与其临床期别和是否有远处转移病灶呈正相关[2]。更有研究发现有大量腹水的病例(>500ml)其肿瘤组织VEGF阳性表达率高于腹水量≤500ml的病例[3]。由此可见上皮性卵巢癌极易在腹腔内广泛种植转移以及大量腹水形成的特性与VEGF的表达与分泌增多相关。本研究采用不同细胞因子诱导卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞系,通过三维培养来观察卵巢癌细胞形成血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)的能力,并以划痕实验和侵袭实验来判断细胞因子VEGF-α诱导对卵巢癌细胞侵袭、迁移能力的影响。

材料和方法

1. 材料

人卵巢腺癌细胞(OVCAR-3)和人卵巢腹水腺癌细胞(SKOV-3)均为美国ATCC公司产品,天津医科大学免疫学教研室保存。基质胶Matrigel购自BD公司,Transwell侵袭小室购于Corning公司。

2.实验方法

2.1 细胞培养 SKOV-3和OVCAR-3细胞均用含有10%FBS的 RPMI-1640培养液培养,培养液中含有100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素。细胞常规培养于37℃含5%CO2的饱和湿度培养箱中,每2-3d传代一次。

2.2 细胞分组 将卵巢癌细胞系 SKOV-3和OVCAR-3分别分为四组进行实验:①VEGF-α组:RPMI-1640培养基中加20ng/ml VEGF-α ;②EGF组:RPMI-1640培养基中加20ng/ml EGF;③FBS组:RPMI-1640培养基中加10%胎牛血清;④对照组:RPMI-1640培养基。

2.3 三维培养 配制实验用培养基,包括VEGF-α、EGF和 FBS等因子(浓度为终浓度的 2倍);以5倍实验用培养基在冰上稀释Matrigel,获得三维培养基,始终保持冰上操作;消化细胞并计数,RPMI-1640悬浮细胞,并与三维培养基等体积混合;37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养21d,连续观察。倒置显微摄影系统拍照并分析。

2.4 细胞划痕试验 以合适的密度将细胞接种于6孔板,于37℃孵箱中培养;待培养细胞生长至80%汇合时,用200 lTip头在细胞表面制造伤口,并在倒置显微镜下观察,拍照记录伤口间初始距离(0 time);在 12、24、36h 后 ,再次于倒置显微镜下观察,拍照记录伤口间的距离,计算细胞的相对迁移率。实验重复3次。

2.5 侵袭实验 将 Transwell小室预冷至4℃,在滤膜外表面涂趋化剂 EGF 25μl(5μg),倒置超净台内风干;冰浴环境下在 Transwell小室滤膜内面涂用无血清 RPMI-1640培养液溶解并稀释的Matrigel胶50μl(0.2μg/μl),37℃孵育1 h使Matrigel胶在微孔滤膜上重组为基底膜结构后备用;在24孔板内加入含0.1%BSA的RPMI-1640无血清培养液,600μl/孔;用含 0.1%BSA 的 RPMI-1640无血清培养液调整各组细胞浓度为2×106/ml,在小室内加入100μl细胞悬液后,将小室浸入24孔板的条件培养基中,37℃、5%CO2孵箱孵育8 h;将Transwell小室取出,滤膜用4%的中和甲醛固定3-5 min;HE染色:苏木精染色2 min,水洗;伊红染色20 sec,水洗;用棉签拭去微孔滤膜上的Matrigel胶和未穿过膜的细胞;于200倍相差显微镜下,应用ACT-2U软件(Nikon Corporation)捕捉图像并计数滤膜上下左右中5个不同视野下穿过膜的细胞数,计算均值。每种细胞平行设2张滤膜,实验重复3次。

2.6 统计学处理 结果应用 SPSS17.0统计学软件处理系统,所有数据均以均数±标准差表示,P<0.05认为有显著性差异。

结 果

1.三维培养试验

卵巢癌细胞系 SKOV-3和OVCAR-3三维培养结果表明,两种细胞系形成网络样结构的能力没有明显的不同。在 VEGF-α组 SKOV-3和OVCAR-3细胞在Matrigel基质中培养第5d开始彼此连接形成网络样结构,培养第10d可观察到大量、明显的血管样网状结构(图1)。FBS组可观察到少量网络样结构形成。EGF组和对照组未观察到卵巢癌细胞彼此连接形成的网络样结构。

图1 VEGF-α组卵巢癌细胞系 SKOV-3(A)和OVCAR-3(B)三维培养第10天结果,白色箭头显示中空的管状结构的横断面,×100.Fig.1 Bright-field microscopy of SKOV-3 and OVCAR-3 cells cultured on three-dimensional matrigel matrix for 10 days.The white arrows show the cross-section of the tubular networks indicating that they contain hollow lumen-like structures, ×100.

2.细胞划痕试验

实验采用经典的细胞划痕试验来评价细胞因子诱导后卵巢癌细胞系SKOV-3和OVCAR-3的迁移能力。实验结果表明:卵巢癌细胞系经细胞因子诱导后,其迁移能力明显增强,其中 EGF组卵巢癌细胞在24h伤口基本愈合,VEGF-α组细胞在36h伤口基本愈合(图2)。两组伤口愈合速度均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。虽然VEGF-α组和 EGF组卵巢癌细胞均能在36h内将伤口全部愈合,但形态学观察显示,在 VEGF-α组卵巢癌细胞形态发生了明显的改变,部分细胞呈梭形或多边形,细胞多突起且细胞排列疏松(图3);而EGF组细胞形态上没有观察到任何改变,细胞排列紧密(图4)。

图2 细胞划痕试验测定细胞迁移能力Fig.2 Cell scratch test for cell migration. There was a significant difference between the EGF group,FBS group,and VEGF-αgroup on the speed of wound healing when compared with the control group(p<0.05).

3.Transwell体外侵袭试验

侵袭和转移是恶性肿瘤的基本特征。肿瘤细胞侵袭基底膜是肿瘤转移过程中的重要环节,Matrigel胶是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分,含有Laminin、Ⅳ型胶原等,铺在孔径为 8.0μm的多聚碳酸脂膜上,能在培养基中重组形成与天然基底膜极为相似的膜结构。具有侵袭能力的细胞在趋化剂的诱导下可穿过滤膜。通过统计穿过滤膜的细胞数可检测肿瘤细胞的侵袭能力。

图3 细胞划痕试验 VEGF-α组Fig.3 Cell scratch test VEGF-αgroup.

将小室浸入24孔板的条件培养基中,37℃、5%CO2孵育8h后,与对照组相比,卵巢癌细胞侵袭至滤膜下表面的细胞数明显增多(表 1),其中VEGF-α能够明显增强卵巢癌SKOV-3和OVCAR-3细胞的体外侵袭能力(图 5),是 EGF的3倍,是对照组的 10倍(P<0.01)。

图4 细胞划痕试验EGF组Fig.4 Cell scratch test EGF group.

表1 不同细胞因子作用后卵巢癌细胞系体外侵袭能力的变化Table 1 Cell count of invasion assay after induced by different cytokines

图5 OVCAR-3细胞体外侵袭实验.(A)VEGF-α组;(B)EGF组;(C)FBS组;(D)Cont.组.Fig. 5 Invasion assay(A)VEGF-α group;(B)EGF group;(C)FBS group;(D)Control group.

图6 Transwell体外侵袭实验Fig.6 Invasion assay. SKOV-3 and OVCAR-3 cells were processed for invasion assay(A,B). The invasion activity enhanced by VEGF-αstimulation was three times higher than that of the EGF group both in SKOV-3 and in OVCAR-3 cells(P<0.01),and about ten times more than that of the free-FBS control group(p<0.01),measured by A595(Figure A)and cellcount(Figure B),respectively.

讨 论

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,其发病率在女性生殖道恶性肿瘤中位于第三位,死亡率高居妇科恶性肿瘤的首位。大量研究结果证实,卵巢癌组织的生长、浸润和转移过程都依赖于肿瘤血管的形成。

血管生成拟态就如同胚胎时期的血管形成,肿瘤细胞就如同胚胎期的多项分化潜能的间充质干细胞,可选择性表达某些血管内皮细胞相关基因,形成血管内皮细胞样表型,分化成血管内皮样细胞,形成原始的规律的血管样网络结构[4]。肿瘤细胞模拟其它细胞类型的基因表达和生物学行为的特性被称为“可塑性”,肿瘤细胞的“可塑性”是VM形成的分子基础。在一些特定的条件下,如缺氧诱导的体外三维培养后,肿瘤细胞通过自身变形和基质重塑直接形成特有的微循环管道,通道内无血管内皮细胞衬覆,形成血管生成拟态[5]。

郝希山等[6,7]在分析双向分化肿瘤的VEGF表达与血管生成拟态的关系时发现:VEGF是由肿瘤细胞分泌并作用于内皮细胞的,肿瘤细胞分泌的VEGF可促进肿瘤血管通透性升高,造成大量血浆蛋白外渗,提供了促进血管生成拟态和新生血管的暂时性基质。Takahashi等[8]研究发现在 GIST中,VEGF表达与血管生成密切相关,它高表达可以视为一个影响 GIST病人预后的不利因素。Fujimoto等[9]在对 128例卵巢癌及 20例正常对照进行VEGF表达检查证实,癌组织中VEGF阳性表达率明显高于正常组织。

本研究以不同细胞因子作用卵巢癌细胞,观察卵巢癌细胞体外侵袭、迁移和形成VM能力的变化。在VEGF-α组观察到细胞彼此连接形成明显的血管样网状结构,在FBS组由于血清中含有丰富的细胞因子,也观察到少量网络状结构形成,可见在加入外源性的VEGF-α后,卵巢癌细胞在三维培养基中形成血管样网状结构即VM的能力明显增强。体外侵袭实验和细胞划痕试验结果表明,VEGF-α组卵巢癌细胞的体外侵袭能力和迁移能力显著增强,证实VEGF-α具有促进卵巢癌侵袭、迁移的作用。

卵巢癌细胞受 VEGF-α刺激后,可能通过增加卵巢癌细胞及其周围纤维细胞和血管内皮细胞的金属蛋白酶等胶原酶的表达,通过降解基底膜和细胞间基质,增强了卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力,使肿瘤细胞易于移出,有利于卵巢癌的转移。在细胞划痕试验中形态学观察显示:VEGF-α组卵巢癌细胞形态发生了明显的改变,部分细胞呈梭形多突起,而EGF组卵巢癌细胞形态没有发生任何改变,进一步说明VEGF-α能够促进卵巢癌细胞的塑形性改变,是卵巢癌血管生成拟态形成中的重要调控因子。

肿瘤的抗血管生成治疗作为很有前途的一种肿瘤综合治疗手段,越来越受到人们的关注,但目前的肿瘤抗血管生成治疗的研究未能达到人们预期的结果。VM现象解释了抗内皮细胞治疗肿瘤疗效不佳的原因,由于血管生成拟态是独立于肿瘤血管生成的肿瘤获得血供的途径,且在血管生成拟态中肿瘤细胞直接与血液接触,肿瘤细胞更容易发生血行转移,所以临床上这类肿瘤常常对化疗不敏感,预后很差。以VEGF及其受体为靶向,应用某些机制阻断VEGF与其受体结合、VEGF的信号传导(如 E-phA2干扰、MMPs抑制剂、抗 laminin-5γ2链抗体等),从而达到抑制肿瘤生长和转移的目的,这些必将成为治疗卵巢癌研究领域的热点。但是,VM机制提出的时间不长,仍有许多问题需要解决,如VM在不同肿瘤中的调控机制有何差异;VM的特异性标记物是什么;VM和血管生成是否存在共同治疗靶点等。随着对肿瘤血管生成拟态的研究不断深入,尤其是对VM分子调节通路的深入研究,必将更加完善和促进肿瘤的抗血管生成治疗的研究。

[1]Byrne AM,Bouchier-Hayes DJ,Harmey J H.Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor.J Cell Mol Med,2005,9(4):777-794

[2]Ueda M,Terai Y,Kumagai K,et al.Vascular endothelial growth factor C gene expression is closely related to invasion phenotype in gynecological tumor cell.Gynecol Oncol,2001,82(1):162-166

[3]Mesiano S,Ferrara N,Jaffe RB.Rile of vascular endothelial growth factor in ovarian cancer:Inhibition of ascites formation by immunoneutralization.Am J Pathol,1998,153(4):1249-1256

[4]黄海波,韩振国.血管生成拟态研究进展.中华医学网络杂志,2004,(1)7:1-4

[5]尧良清,丰有吉,丁景新,等.缺氧诱导卵巢上皮性癌细胞形成拟态血管的前期研究.中华妇产科杂志,2005,40(10):662

[6]Sun B,Zhang D,Zhang S,et al. Hypoxia influences vasculogenic mimicry channel formation and tumor invasion-related protein expression in melanoma.Cancer Lett,2007,249(2):188-197

[7]郝希山,孙保存,张诗武,等.双向分化肿瘤血管生成拟态的组织微阵列研究.中华医学杂志,2002,82(19):1298-1302

[8]Takahashi R,Tanaka S,Kitadai Y,et al.Expression of vascular endothelial growth factor and angiogenesis in gastrointestinal stromal tumor of the stomach.Oncology,2003,64(3):266-274

[9]Fujimoto J,Sukaguchi H,Hirosc R,et al.Biologic implications oftheexpression ofvascularendothelial growth factor subtypes in ovarian carcinoma.Cancer,1998,83(12):2528-2533

Effect of VEGF-αinduction on vasculogenic mimicry formation,invasion and migration ability of human ovarian carcinoma cell lines

Wang Junyan,Wang Li,Sun Tao1,Zhao Xiulan1,Zhao Nan1,Sun Baocun1＊

(Department ofHistology and Embryology,Tianjin Medical University;1Department ofPathology,Tianjin Medical University,Tianjin300070,China)

Objective To investigate the effect of VEGF-αon ovarian carcinoma vasculogenic mimicry formation,invasion and migration.Methods The ovarian carcinoma cell lines SKOV-3 and OVCAR-3 were induced by different cytokines.After that the three dimensional culture was used to observe VM formation. Invasion and wound healing assays were performed to judge the invasion and migration ability. Results Three-dimensional culture results demonstrated that both SKOV-3 and OVCAR-3 cells,when stimulated by VEGF-α,formed typical pipe-like structures after culture within the three-dimensional Matrigel medium.Scratch test showed that the treatment of cells with cytokines markedly enhanced the cell migration into the denuded area. Conclusion VEGF-α is regarded as the key regulation molecule in VM formation,invasion and migration,of ovarian carcinoma cell lines.

VEGF-α; Ovarian carcinoma; Vasculogenic mimicry; Invasion; Migration

R730

A

10.3870/zgzzhx.2011.01.011

2010-09-01

2010-10-11

天津市应用基础及前沿技术研究项目(10JCYBJC12900)

王俊艳,女(1973年),汉族,副教授。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)