超高效液相色谱串联质谱法同时测定水产品中6种兽药残留

隋 涛，付 建，李晓玉，郭海霞，娄喜山

(1.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000；2.烟台杰科检测服务有限公司，山东 烟台 265231)

超高效液相色谱串联质谱法同时测定水产品中6种兽药残留

隋 涛1，付 建2，李晓玉1，郭海霞2，娄喜山2

(1.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000；2.烟台杰科检测服务有限公司，山东 烟台 265231)

采用液液萃取的前处理方式，以超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)检测水产品中萘啶酸、泰妙菌素、甲氧苄胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素和吡喹酮的残留量。水产品经过匀质，乙腈提取并沉淀蛋白，正己烷去除脂肪，UPLC-MS/MS进行检测，在6min内完成分离。在5～200μg/L范围内，相关系数R2在0.9977～0.9999之间，具有良好的线性关系。6种物质的检测限度均为1.0μg/kg，回收率范围在61.2%～90.5%之间。本方法操作简单、灵敏度高，可以满足水产品中农药残留的的定性定量检测。

萘啶酸；泰妙菌素；甲氧苄胺嘧啶；二氟沙星；氟甲砜霉素；吡喹酮；超高效液相色谱串联质谱；多反应监测

萘啶酸为第一代喹诺酮类抗菌药物，对大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属、肠杆菌属及流感嗜血杆菌的部分菌株具抗菌活性。泰妙菌素是一种双萜类动物专用抗生素，主要用于防治家畜家禽呼吸系统疾病和动物促生长，是世界十大兽用抗生素之一。甲氧苄胺嘧啶是一种抗菌药物，抗菌谱与磺胺药相近，具有抑制二氢叶酸还原酶的作用。二氟沙星是动物用抗菌药，属于氟喹诺酮类。氟甲砜霉素是兽用抗菌药，用于敏感细菌所致的猪、鸡及鱼的细菌性疾病。吡喹酮为一新型广谱抗寄生虫药。结构式见图1。

韩国国立水产物品质检查院计划2010年增加针对水产品的检测项目，新增抗生素类项目12项，其中包括萘啶酸(nalidixic acid)、吡喹酮(praziquantel)、泰妙菌素(tiamulin)、二氟沙星(difloxacin)、甲氧苄胺嘧啶(trimethoprim)、氟甲砜霉素(florfenicol)，在鱼类或甲壳类中的限量分别为0.03、0.02、0.1、0.3、0.05、0.1mg/kg。

从目前文献和资料方法来看，抗生素类检测方法的对象局限于单类抗生素在一种或多种基质中的残留[1-5]。本实验研究的6种兽药检测方法也多为单一检测[6-14]，且所用仪器多为液相色谱，定量不够准确，灵敏度也不够高。萘啶酸的检测尚无相关国家标准和行业标准，泰妙菌素、甲氧苄胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素、吡喹酮5种药物虽然分别有相关的国家标准或行业标准，但每个项目均为独立的前处理方法和仪器检测方法，不能同时、快速分析检测。分析时间长，成本高，效率非常低，难以有效地对其出口安全性进行监控。因此，建立一种可以同时、快速检测上述药物的标准方法对人们的身体健康和出口贸易都有十分重要的意义。

图1 6种兽药的结构式Fig.1 Structures of six veterinary drugs

本实验旨在建立快速萃取后进样同时测定水产品中萘啶酸、泰妙菌素、甲氧苄胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素、吡喹酮的超高效液相色谱串联质谱法。该法具有可多种兽药同时分析、操作简便、测定速度快等优点，适应目前出口食品的快速通关检测工作的需要，也可作为企业内控检测的标准方法，从而提高企业出口产品安全性，降低企业检测成本。

1 材料与方法

1.1 试剂

乙腈、甲醇(均为色谱纯) 德国默克公司；正己烷、甲酸(均为色谱纯) 天津科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水，乙酸铵为优级纯。

6种标准物质(纯度)：萘啶酸(99.5%)、泰妙菌素(98.5%)、甲氧苄胺嘧啶(99.5%)、二氟沙星(98.4%)、氟甲砜霉素(99.0%)、吡喹酮(99.0%) 德国Dr.Ehrenstorfer公司。

单标储备液制备：用天平准确称取0.0100g标准物质，用乙腈配制成100mg/L的标准储备液，4℃避光保存。

混合标准工作液的制备：准确移取一定量的混合标准储备液置于容量瓶中，用乙腈与水混合溶液(4:6，V/V)定容至刻度线，逐级稀释成2、5、10、25、50、100 μg/L的标准工作混合液，于4℃条件下保存。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪UPLC、Premier四极杆串联质谱仪 美国Waters公司；Rios 8超纯水仪 美国Millipore公司；T18均质器 德国IKA公司；N-1100旋转蒸发仪 日本东京理化器械株式会社；DL-5C离心机 上海安亭科学仪器厂；孔径0.22μm 的滤膜。

1.3 样品处理

称取5.00g匀质后的样品、5g无水硫酸钠，置于50mL离心管中，加入20mL乙腈，振荡提取10min，4000r/min离心5min，上清液转移至125mL分液漏斗中，残渣中加入20mL乙腈，再次提取1次，合并上清液至分液漏斗中。向分液漏斗中20mL乙腈饱和的正己烷溶液，混合均匀，静置分层，分取乙腈层至茄形瓶中。40℃水浴条件下旋转蒸发至干，准确加入1mL乙腈-水(4:6，V/V)混合溶液和1mL乙腈饱和正己烷，超声使其完全溶解，将溶液转移至2.0mL小离心管中，12000r/min高速离心10min。吸取下层过0.22μm的滤膜。待检测。

1.4 超高效液相色谱-质谱联用分析

1.4.1 色谱条件

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)；流动相：甲醇-5mmol/L 乙酸铵溶液(0.1%甲酸)，梯度洗脱程序见表1； 流速：0.25mL/min；柱温35℃；进样量：3μL。首先用一个等梯度洗脱程序，观察每一种化合物出峰的出峰顺序，后确定一个较为粗略的梯度洗脱程序，通过不断优化和实验最终确定一个最佳的梯度洗脱程序。

1.4.2 质谱条件

采用ESI离子源；扫描方式：由于氟甲砜霉素含有电负性较强的氯基团，因此确定为负离子扫描，萘啶酸、泰妙菌素、甲氧苄胺嘧啶、二氟沙星、吡喹酮为正离子扫描；正离子模式下毛细管电压：3.0kV，负离子模式下毛细管电压为2.6kV；离子源温度：110℃；脱溶剂温度：350℃。首先对每一种标准品的单标进行蠕动进样，通过分别界定母离子和子离子的扫描范围进行全扫描以确定母离子和子离子对的准确值，然后分别通过改变不同的锥孔电压和碰撞能值使化合物的出峰灵敏度达到最高以使锥孔电压和碰撞能值达到最优。

2 结果与分析

2.1 质谱分析与方法定性

分别将6种5mg/L的单独标准溶液以蠕动泵进样的方式注入到质谱中，萘啶酸、泰妙菌素、甲氧苄胺嘧啶、二氟沙星、吡喹酮在ESI+方式下进行一级质谱全扫描分析，可以找到准确的[M+H]+分子离子峰。氟甲砜霉素在ESI+方式下离子化强度远弱于ESI-，因此氟甲砜霉素选择在ESI-方式下进行MRM分析。用daughterscan 方式对子离子及碰撞能量进行优化。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

本研究选用适用于Acquity UPLC的3种专用反相色谱柱，在其他质谱与液相条件相同的情况下，比较各色谱柱对6种物质的保留情况、灵敏度、峰形等。3种色谱柱规格为：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column(2.1mm×100mm，1.8μm) (简写：T3)；Waters ACQUITY SHIELD RP18 Column(2.1mm×100mm，1.7μm)(简写：RP)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18Column (2.1mm×100mm，1.7μm) (简写：C18) 。

表2 6种兽药的UPLC-MS/MS仪器参数Table 2 LC-ESIMS/MS parameters for 6 veterinary drugs

图2 6种兽药不同色谱柱下的色谱图Fig.2 Chromatographic plots of six veterinary drugs separated by column

从图2可以看出，RP柱与C18柱的分离度相似，T3柱对甲氧苄胺嘧啶、吡喹酮的保留性要明显优于RP柱和C18柱。灵敏度由大到小排序为：T3＞RP＞C18。所以最终选择Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column为样品分析柱。

2.2.2 流动相的选择

流动相中使用缓冲盐(乙酸铵)可以增加6种物质的保留性；加入适当的甲酸可以促使化合物电离，提高灵敏度。甲醇与乙腈相比，极性较弱，同样流动相梯度条件下，使用甲醇时，目标物的保留时间靠后；同时甲醇为质子化试剂，用甲醇做流动相，目标物的离子化程度高，灵敏度相对也高，记过显示：用甲醇做流动相目标物的峰面积是乙腈做流动相时的2倍。因此选择甲醇-5mmol/L乙酸铵溶液(含体积分数0.1%甲酸)作为流动相。

2.2.3 前处理条件的选择

本研究旨在快速同时分析这6种物质，因此前处理时间也是一个重要的控制点。本研究舍弃了SPE净化手段，选择了耗时少、分析成分低的液液萃取净化方式。用乙腈提取样本中的目标物，同时达到沉淀蛋白的目的；采用正己烷与乙腈液液分配去除脂肪和脂溶性杂质；定容后再用乙腈饱和正己烷去一次油脂，同时12000r/min以上高速离心，去除大分子杂质。

实验结果表明，定溶液中加入甲酸会影响氟甲砜霉素的灵敏度，响应面积约降低1倍，最终定容液未加酸。

2.3 方法性考察

表3 6种兽药的线性范围、线性方程及相关系数Table 3 Linear ranges, regression equations and related coefficients for 6 veterinary drugs

6种兽药线性考察见表3。在6min内完成分离。在5～200μg/L的质量浓度范围内，相关系数R2在0.9977～0.9999之间，具有良好的线性关系。

向马哈鱼、鲅鱼、海铺虾空白样品中添加3个水平的6种混合标准溶液，按1.3节方法做回收率实验。每个添加水平重复6次，计算添加回收率和结果相对标准偏差，结果见表4。根据RSN≥10作为检出限，6种物质的检测限度均为1.0μg/kg，回收率范围在61.2%～90.5%之间。

表4 方法的加标回收率Table 4 Recovery rates of spiked samples

3 结 论

本研究采用乙腈提取目标物并沉淀蛋白、正己烷去除脂溶性杂质，可基本排除水产品基质对离子化的影响；采用超高效液相色谱串联质谱仪进行检测，灵敏度高、定性定量准确。与普通液相色谱相比，定性和定量更加准确，通过不同检测人员对阳性结果进行复检基本可以排除假阳性的错误结果。而且大大提高了检测灵敏度，使得检测结果由几十、几百ng/g甚至μg/g级提高到1.0ng/g，可以更好的应对国外的技术壁垒。另外，超高效液相色谱(UPLC)与高效液相色谱(HPLC)相比由于具有小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等技术，增加了分析的通量及色谱峰容量，与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。本实验在5～200 μg/L质量浓度范围内具有良好的线性关系，6种分析物质的检测限度均为1.0μg/kg，回收率范围在61.2%～90.5%之间，相对标准偏差均不大于12.5%。本研究能够满足快速同时分析水产品中萘啶酸、泰妙菌素、甲氧苄胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素、吡喹酮检测的需求。

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Simultaneous Determination of Veterinary Drug Residues in Aquatic Products by UPLC-MS/MS

SUI Tao1，FU Jian2，LI Xiao-yu1，GUO Hai-xia2，LOU Xi-shan2
(1. Yantai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China；
2. Yantai Jieke Inspection Service Co. Ltd., Yantai 265231, China)

A method for detecting residues of nalidixic acid, tiamulin, trimethoprim, difloxacin, florfenicol and praziquantel in aquatic products by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)after liquidliquid extraction approach was established. The samples were extracted using acetonitrile as the solvent, purified by hexane and detected by UPLC-MS/MS within 6 minutes. The linear regression coefficients corresponding to 6 spiked levels in the range of 5 to 200 μg/L were between 0.9977 and 0.9999. The detection limit for each of the six substances was 1.0 μg/kg, and their recoveries were in the range of 61.2% to 90.5%. The developed method is simple and sensitive and can meet the requirements for qualitative and quantitative analysis of aquatic products.

nalidixic acid；tiamulin；trimethoprim；difloxacin；florfenicol；praziquantel；ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)；multiple-reaction monitoring (MRM)

O657.63；S859.84

A

1002-6630(2011)10-0203-05

2010-07-15

2010年度山东检验检疫局科研项目(SK201030)

隋涛(1966—)，男，工程师，本科，研究方向为食品中的药物残留检测。E-mail：ytst2009@163.com