丁香挥发油的体外抗氧化作用研究

郑州拓洋实业有限公司 苏筱渲 徐 琳 吴 娜

丁香挥发油的体外抗氧化作用研究

郑州拓洋实业有限公司 苏筱渲 徐 琳 吴 娜

丁香为桃金娘科植物丁香（Eugenia caryophyllata Thun.）的干燥花蕾，是药食两用植物。丁香中主要含有有机酸类、苷类、挥发油类、黄酮类等有效成分，具有广泛的生理活性。经研究丁香挥发油的主要成分有丁香酚、石竹烯、异丁香酚、檀香醇等具有抗氧化活性成分。近年来，随着对传统合成抗氧化剂BHT，BHA，TBHQ等毒性问题的提出，天然抗氧化剂越来越受到食品饲料等行业的青睐，特别是植物源抗氧化剂，因其具有来源广泛、提取率高、抗氧化性强、与机体亲和力强和安全性高等优点，使天然抗氧化剂的研究逐渐成为热点。本文，笔者旨在讨论丁香挥发油的抗氧化作用及其机制，为开发丁香挥发油提供参考和依据。

一、材料与仪器

采用在药材市场购买的丁香干花蕾。实验动物为昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体重（20±2）g，由河南省疾控中心提供。鲁米诺，色谱纯，Sigma公司产品；MDA测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；其他均为国产分析纯试剂。

分析天平（AE240），梅特勒公司；旋转蒸发仪，中国巩义予华；化学发光仪（PHOTOCHEM），德国耶拿公司；超临界萃取装置（1L），中国南通华安公司。

二、实验方法

1.丁香挥发油的制备。超临界萃取装置CO2流量控制在15kg/h，每次进样量500g，在30MPa，45℃的条件下，萃取120min，所提取挥发油用乙醚溶解，加无水硫酸钠干燥，过滤，用旋转蒸发器除去乙醚，得淡黄色透明液体。

2.化学发光测量条件。采用BPCL型超微弱化学发光测量仪(中国科学院生物物理所)进行测定，测试条件：Hi-V800；Kv-1；记录的波长范围：180~800nm；温度：30℃。

3.丁香挥发油对超氧阴离子的清除作用检测方法。采用邻苯三酚一鲁米诺化学发光体系。试剂配制方法：鲁米诺用0.05mol/L的NaOH溶液配成lmmol/L的溶液；邻苯三酚用lmmol/L HCL配成6.25×10。mol/L溶液；0.05mol/L pH10.2的Na2CO3·NaHCO3缓冲液（含0.1mmol/L EDTA）与1mmol/L鲁米诺以2∶1（v∶v）混合成鲁米诺和碳酸盐缓冲液混合物。测定方法：向发光池中加入样品溶液（空白对照为无水乙醇，样品溶液用无水乙醇配制）10μL，6.25×10mol／L邻苯三酚50μL，鲁米诺和碳酸盐缓冲液混合物940μL启动反应，间隔2s记数发光强度，测定300s的发光强度，本底发光强度为不加邻苯三酚时的发光值。

4.丁香挥发油对羟基自由基的清除作用检测方法。采用CuSO4-Phen-Vc-H2O2化学发光体系，向发光池中加入样品溶液（以无水乙醇为对照）50μL，1.0mmol/L CuSO4溶液50μL，1mmol/L邻菲啉溶液50μL，和0.05mol/L硼砂溶液700μL（pH9.0），1mmol/L抗坏血酸溶液100μL和0.15%H2O2溶液50μL，立即启动化学发光系统，间隔3s记数，记录400s内化学发光动力学曲线，本底不加双氧水。

5.丁香挥发油对H2O2的清除作用检测方法。采用双氧水-鲁米诺化学发光体系，向发光池中加入样品溶液（以无水乙醇为对照）50μL，0.15mol/L H2O250μL和0.1mmol/L鲁米诺-0.05mol/L pH9.4碳酸盐缓冲液混合液（体积比为1∶17）900μL，启动发光系统，间隔3s记数，记录120s内发光强度，本底不加双氧水。

6.丁香挥发油对体外小鼠肝匀浆生成MDA的测定方法。参照黄晓兰，阎俊，吴晓文，等的研究，制备10%肝组织匀浆液。每支试管加10%小鼠肝匀浆0.2m l，给药组每管分别加浓度为0.05、0.5、2.0、10.0g/L的挥发油0.1mL，对照组加等体积生理盐水，再分别加诱导试液FeSO4（1mmolL）0.1mL、H2O2（1mmolL）0.1mL，37℃温育1h（对照以等体积无水乙醇代替样品溶液），置冰水中冷却，再按MDA试剂盒方法操作，测定A532并计算MDA含量（nmol/mg.pr）。

7.数据处理方法。以抑制O-2·和·OH的发光强度一半的浓度（IC50）为标准，判断丁香挥发油的有效性和效价；实验数据表示为方差分析进行统计学处理。

三、结果与讨论

1.丁香挥发油和VC对超氧阴离子自由基的清除作用。本体系中邻苯三酚在碱性条件下氧化产生超氧阴离子，以鲁米诺为发光剂，超氧阴离子激发鲁米诺，鲁米诺由激发态返回到基态时产生化学发光。抗氧化剂的加入可清除超氧阴离子，从而抑制化学发光。丁香挥发油的有效半数清除浓度（IC50）为175.73mg/L，与260.42mg/L的VC的清除能力相当，而且丁香挥发油对体系中产生的O-2·的抑制率与丁香挥发油的浓度呈正比例关系。丁香挥发油能有效清除超氧阴离子。如表1、图1所示。

图1 不同浓度的丁香挥发油抑制超氧阴离子的化学发光动力学曲线

2.丁香挥发油和VC对·OH的清除作用。本体系中，Cu2+被Vc还原成Cu+，Cu+与H2O2在Fenton反应中产生·OH，·OH氧化邻菲啉（Phen），使Phen激发，Phen退激时产生化学发光。抗氧化剂的加入可清除·OH，降低化学发光强度。丁香挥发油对·OH的清除率随着浓度的增加而增大，量效关系非常明显。丁香挥发油的IC50为28.39mg/L，与13.81mg/L的VC清除能力相当。见表2。羟基自由基是已知的最强的氧化剂，具有极强的反应性，寿命极短，在很多缓冲溶液中，只要一产生，就会同缓冲溶液反应。它几乎可以攻击所有的邻近细胞，同细胞中的所有成分发生反应，对人体的危害最大。该试验结果表明丁香挥发油中含有抗氧化剂，能抑制羟基自由基的氧化。如图2所示。

表2 丁香挥发油和VC清除羟基自由基

图2 不同浓度丁香挥发油清除羟基自由基化学发光动力学曲线

3.丁香挥发油和VC对H2O2的清除作用。本体系中，H2O2能在有O2和碱性条件下氧化鲁米诺产生化学发光。加入一定量的抗氧化剂，清除H2O2，可抑制化学发光。丁香挥发油的IC50为0.24mg/L，VC的IC500.36mg/L，丁香挥发油的清除能力强于VC。见表3。表明丁香挥发油的加入，使发光峰值下降；随浓度的增大，发光更弱。如图3所示。

表3 丁香挥发油和VC清除H2O2

图3 不同浓度丁香挥发油清除H202化学发光动力学曲线图

4.丁香挥发油对体外小鼠肝匀浆生成MDA的影响。与对照组相比较，在实验浓度范围内对自氧化、Fe2+诱导和H2O2诱导3种体系中的小鼠肝匀浆MDA的生成均有极显著的抑制效果，并呈剂量—效应关系。10mg/L丁香挥发油对H2O2诱导的MDA生成抑制率高达74.12%（表4）。说明丁香挥发油对小鼠肝组织自发性脂质过氧化和诱导脂质过氧化均有较强的抑制作用。

表4 丁香挥发油对Fe2+和H2O2诱导小鼠肝匀浆生成MDA（n=10，x±s）

四、结论

自由基学说认为自由基能使细胞受到损害，很多疾病如老年痴呆症、帕金森症、肌萎缩性侧索硬化症，还有癌症等的发生都与自由基有关。本实验采用体外产生活性氧自由基系统，通过对活性氧自由基的清除作用证实丁香挥发油是一种有效的自由基清除剂，对羟基自由基的清除作用更强。丁香挥发油可以抑制小鼠肝的脂质过氧化，从而维持生物膜的完整性，防止生物膜的氧化损伤。丁香资源丰富，尚未得到有效的利用。近年来，有关丁香有效成分和药理作用的研究已经引起一定的关注，本研究的结果为促进丁香资源进一步开发利用提供实验资料。