花生茎中白藜芦醇的提取及体外抗氧化性的研究

程雅芳，李全文，续 颖，杨 洋，李鹏婧，韦小英

(广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530004)

花生茎中白藜芦醇的提取及体外抗氧化性的研究

程雅芳，李全文，续 颖，杨 洋*，李鹏婧，韦小英

(广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530004)

探讨了花生茎中白藜芦醇的提取工艺。通过运用4种不同体系的抗氧化性能测试方法，研究花生茎中白藜芦醇体外清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的能力和还原能力，并将其与常用的维生素C和BHT抗氧剂的抗氧化性能进行比较。结果表明，提取花生茎中白藜芦醇的最佳条件为:乙醇浓度为80%，料液比为1∶20，在50℃条件下浸泡2h，得到的粗提物的得率为0.083%。花生茎白藜芦醇具有较强的抗氧化作用，所含的白藜芦醇是其发挥作用的主要物质基础。

花生茎，白藜芦醇，提取，抗氧化性

白藜芦醇(Resveratrol，简称Res)，别名虎杖甙元，分子式为 C14H12O3，化学名称为(E)－5－［2－(4－羟苯基)－乙烯基］－1，3－苯二酚;3，4'，5－三羟基芪(3，4'，5－trihydrolystil－bene)。目前已经在 21 个科、31个属的72种植物中发现了白藜芦醇，其中，虎杖、葡萄和花生中白藜芦醇含量较高［1－2］。花生(A rachishy pog aea L.)是我国重要的经济作物，年产量已达1500万t，其中30%左右直接和间接用于食用，每年作为食用花生出口有35～45万t，占总产量的5%左右。花生食品安全和功能食品的开发生产是提高人民健康水平、延长农业生产链条、提高花生产品附加值的重要方面。其根茎含有一种芪类结构的非黄酮类多酚化合物白藜芦醇［(Resveratro1)3，4，5－三羟基二苯乙烯］，属于单宁质多酚 。白藜芦醇具有抗氧化、清除自由基、防止老化、抗肿瘤、保护心血管和植物雌激素的作用及保肝的功效，是一种极具开发价值的天然物质［3－4］。目前，世界上有十余个国家和地区在开发白藜芦醇原料及制剂，被喻为继紫杉醇之后的又一新的绿色抗癌药物，被人们广泛关注。利用我国丰富的原料资源花生的副产物，开发相关的保健产品原料资源，具有广阔的市场前景及良好的经济效益，为花生茎白藜芦醇提取物进一步研究和开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白藜芦醇标准品 纯度98%，天津尖峰天然产物有限公司;花生茎提取物 实验室自制;二丁基羟基甲苯(BHT)、维生素C(VC) 食品级;乙醇、甲醇、丙酮、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、邻苯三酚、三羟甲基胺基甲烷(Tris)、浓盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸、铁氰化钾、三氯化铁等其他试剂 均为分析纯。

电热鼓风干燥器 上海实验仪器厂有限公司;PL2002电子天平 梅特勒－托利多仪器有限公司;SB－5200D超声波清洗机 宁波新芝科技股份有限公司;UV1700型分光光度计 岛津(Shimadzu)公司;药物粉碎机 青岛鼎龙科学仪器设备有限责任公司;酸度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生茎白藜芦醇提取物的制备［3－6］在单因素实验的基础上，采用正交设计研究花生茎中白藜芦醇的提取工艺条件，正交实验设计见表1。

表1 正交实验设计方案L9(34)

1.2.2 花生茎中白藜芦醇的测定方法 准确称取干燥至恒重的白藜芦醇标准品5mg，用无水甲醇溶解后移入100m L容量瓶中，无水甲醇定容至刻度，摇匀，得到浓度为50μg/m L标准液备用。

取白藜芦醇标准品适量，加入10m L比色管中，使用紫外－可见分光光度计进行吸收光谱扫描，扫描范围为200～600nm，确定最大吸收波长。

分别精密吸取上述标准液 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0m L置于10m L比色管中，加无水甲醇至刻度，摇匀，分光光度计于波长305nm处，以试剂空白为参比，依次测定各管的吸光度值。

1.2.3 测定总还原力［7－8］分别准确量取2.0m L不同浓度的样品液、VC、BHT，加入2.0m L pH=6.6的磷酸盐缓冲液中，1%的铁氰化钾溶液2.0m L，混合物在50℃恒温20m in后，再加入2.0m L 10%的三氯乙酸溶液，然后以3000 r/m in离心分离10m in，取上层清液5m L，加蒸馏水 4m L，0.1%FeCl3溶液 1m L，混合10m in后，以蒸馏水做参比，于700nm处测定吸光度，吸光度越高，还原能力越强。

1.2.4 清除羟自由基的能力 采用水杨酸法，分别加入9mmol/L的FeSO4溶液2m L，不同浓度提取液、BHT、VC各 2m L，9mmol/L 的水杨酸溶液 2m L，最后加入8.8mmol/L的 H2O2溶液2m L启动反应，摇匀，静置30min后，以蒸馏水为参比，于510nm处测定各反应体系的吸光度;同时用水代替双氧水，测得本底吸收吸光度AX0。根据下式计算试样液的清除率:

IC50表示清除率为50%时体系中的供试物浓度，即半数清除浓度。以清除率为纵坐标，各供试物浓度为横坐标，建立回归方程，计算 IC50，并将 VC和BHT分别配制成不同浓度的溶液，按上述方法测定吸光度，计算清除率和IC50。

1.2.5 清除超氧自由基的能力 将4.5m L 0.05mol/L的Tris－HCl(pH8.2)，加入1.0m L不同浓度的提取液，3.2m L蒸馏水，于25℃水浴中预热20m in后，加入0.3m L 3mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后，在波长325nm处，立即测定反应体系的吸光度Ai;空白管以10mmol/L HCl代替邻苯三酚，作为对照。以吸光度值A对反应时间t作线性关系图，求出斜率为Ai，清除率按下式计算:

1.2.6 清除DPPH自由基的能力 分别在4.00m L DPPH·溶液中加入0.2m L不同种类的溶液，混匀放置30m in后，用1cm比色皿于517nm处测定吸光度，即为Ai，同时在4.00m L DPPH·溶液中加入0.2m L溶剂，同样条件下测定吸光度，即为A0;用4.00m L溶剂取代DPPH溶液所得吸光值即为Aj，按下式计算DPPH·清除率(Y):

2 结果与分析

2.1 正交实验优化花生茎白藜芦醇的提取工艺参数

以花生茎为原料，结合单因素实验所得结果，采用正交实验法优化提取工艺，正交实验结果、方差分析见表2和表3。由实验结果得知，影响因素的大小顺序为A＞B＞D＞C，乙醇浓度是最主要因素，其次是料液比和提取温度，最后是时间;最佳提取条件为:A3B3C3D1。为验证正交实验最优化条件，取花生茎原料3.0000g，即按照1∶20的料液比加入浓度为80%的乙醇60m L，在50℃下提取2h，白藜芦醇的得率为0.083%，是本实验范围内的最高值。经冷冻干燥后得到粗提物，通过静态吸附、解吸实验筛选出NKA－9大孔树脂作为层析柱填料，通过单因素优化了白藜芦醇的富集、分离条件。其吸附最佳条件为:上柱液流速1m L/m in，白藜芦醇浓度为0.2mg/m L;解吸最适条件为:流速1.5m L/m in;用不同浓度的乙醇溶液梯度洗脱，合并相同组分，经浓缩、冷冻干燥制得纯度较高的白藜芦醇纯化物。

表2 正交实验结果

表3 A305nm的方差分析

2.2 总还原力的测定

从图1可以看出，经过纯化之后的花生茎白藜芦醇提取物具有较高还原能力，而且和浓度呈线性关系，比同浓度的VC和BHT均高。因此也可以证明，白藜芦醇具有较高的还原能力。

图1 还原力的测定结果

2.2 清除羟自由基能力的实验

由图2可以看出，花生茎白藜芦醇提取物对羟自由基的清除效果是非常显著的，明显优于VC和BHT。虽然花生茎纯化物在最初时的清除率稍低于BHT，但随着浓度的增加，花生茎白藜芦醇纯化物的清除率明显增加，因此在浓度达到100μg/m L时，清除率已经优于BHT。表4显示，四种样品中，白藜芦醇纯化物的IC50最低，接下来依次是BHT、粗提物、VC，表明纯化物对羟基的清除效果最佳，说明白藜芦醇对羟基有较强的清除抑制作用。

表4 白藜芦醇对羟自由基的半数抑制浓度

图2 白藜芦醇对羟自由基的清除效果

2.3 清除超氧阴离子自由基能力的实验

从图3可以看出，花生茎的提取物具有一定的清除超氧阴离子自由基的能力，花生茎的纯化物的清除效果可以和同等浓度的抗氧化剂VC相媲美，并且明显优于BHT。这说明花生茎提取物具有很好的抗氧化效果。由表5可以看出，白藜芦醇的纯化物的半数抑制浓度最低，与同浓度的常见的抗氧化剂VC、BHT相比，效果都要好。

表5 白藜芦醇对超氧阴离子自由基的半数抑制浓度

图3 白藜芦醇对超氧阴离子自由基的清除作用

2.4 清除DPPH自由基能力的实验

图4结果显示，随着反应液中白藜芦醇浓度的增大，对DPPH自由基的清除率呈上升趋势，当浓度为200μg/m L的时候，清除率达到了90%左右。提取液在白藜芦醇浓度较低的情况下也表现出较强的清除效果，50μg/m L时清除率也可达到41%，可见白藜芦醇对DPPH自由基有良好的清除效果。由表6可以看出，白藜芦醇纯化物对DPPH的半数抑制浓度仅为74.394μg/m L，比其他的都要低很多，也就证明了它的清除效果是最佳的。

表6 白藜芦醇对DPPH自由基的半数抑制浓度

图4 白藜芦醇对DPPH·的清除效果

3 结论

3.1 确定了提取花生茎中白藜芦醇的最佳条件为:乙醇浓度为80%，料液比为1∶20，在50℃条件下浸泡2h，得到的粗提物的得率为0.083%。

3.2 花生茎中白藜芦醇的还原能力略高于VC，但明显优于BHT。花生茎中白藜芦醇无论是粗提物还是经过纯化的提取物对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基都具有较高的清除抑制效果，而且浓度越高，清除效果越好。

3.3 纯化得到的花生茎白藜芦醇样品在实验范围内，对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的半数抑制浓度分别为:50.260、64.080、74.394μg/m L。

［1］Paola Signorelli，Riccardo Ghidoni.Resveratrol as an anticancer nutrient:molecular basis，open questions and promises［J］.Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16:449－466.

［2］余慧琳.白藜芦醇的生理功能及其应用前景［J］.生物学通报，2005，40(11):12－13.

［3］洪志哲，唐明增.虎杖中自藜芦醇成分研究新进展［J］.实用中医内科杂志，2005，19(3):200－201.

［4］刘大川，刘强.一种多酚类化合物－白藜芦醇的开发研究［J］.中国油脂，2004，29(4):9－11.

［5］Dalei Zhang，Xiunan Li，Dongxia Hao，et al.Systematic purification of polydatin，resveratrol and anthraglycoside bfrom Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc［J］.Separation and Purification Technology，2009，66:329－339.

［6］刘淼.中草药成分提取分离与制剂加工新技术新工艺新标准实用手册［M］.北京:中国教育出版社，2004.

［7］楚文靖.紫甘薯酒的加工和抗氧化活性研究［D］.南宁:广西大学，2005.

［8］Smimof N，Cumbes QJ.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes［J］.Phytochemistry，1989，28(4):1057－1060.

Study on extraction and antioxidant ability of resveratrol from peanut stem

CHENG Ya－fang，LIQuan－wen，XU Ying，YANG Yang*，LI Peng－jing，WEI Xiao－ying
(College of Life Science And Technology，Guangxi University，Nanning 530004，China)

The technology of extracting resveratrol from the stem of peanuts was investigated.With test methods of four different systems of antioxidation ability，the scavenging activities of resveratrol from peanut stem on hydroxyl free－radical(·OH)，superoxide anion free－radical(O2－·)，DPPH free－radical(DPPH·)and deoxidating activity were studied and compared with the VCand BHT by spec trophotometry.The results showed that resveratrol in peanut stem was a natural antioxidation and had strong antioxidant capacity which might result from the resveratrol in it.The optimum extraction conditions were as follows:the rate of solid to solution is was 1∶20，the concentration of ethanol was 80%，the temperature was 50℃，abstraction time was 2h.Under the optimized condition，the yields of resveratrol were 0.083%.

peanut stem;resveratrol;extracting;antioxidation

TS255.6

A

1002－0306(2011)07－0144－03

2010－06－12 *通讯联系人

程雅芳(1984－)，女，在读硕士，研究方向:生物制药研究。