产β-半乳糖苷酶的节杆菌诱变选育及培养基优化

唐 蕾，董晓璇，李珍爱，孙慧慧，杨瑞金，毛忠贵，*

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122;

2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

产β-半乳糖苷酶的节杆菌诱变选育及培养基优化

唐 蕾1，董晓璇1，李珍爱1，孙慧慧1，杨瑞金2，毛忠贵1，*

(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122;

2.江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

酶法合成乳果糖需要使用同时具备水解和转苷活力的β－半乳糖苷酶为催化剂。采用物理诱变，培养基优化手段，以提高细菌产该类β－半乳糖苷酶的能力为目的，自然筛选获得的具有转苷能力的节杆菌Arthrobacter sp.，经紫外线照射处理，采用5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X－gal)为平板筛选显色剂，加之摇瓶发酵筛选，得到8株产酶水平明显提高的诱变株，其中Arthrobacter sp.M2酶活力较野生株提高了89%，传代5次酶活基本稳定。采用正交实验优化产酶培养基，结果表明:在乳糖浓度为10g/L，玉米浆浓度为22g/L，Fe3+浓度为1.5mmol/L时效果最佳，酶活水平进一步提高了113%。紫外诱变和培养基优化有效地提高了节杆菌产β－半乳糖苷酶的水平。

节杆菌，紫外诱变，β－半乳糖苷酶

乳果糖是由半乳糖和果糖以β－1，4－糖苷键结合而成的二糖，它可以促进双歧杆菌增殖，具有调整肠道菌群平衡，治疗肝性脑病、降低内毒素、预防结肠息肉术后复发等功效，因而已被很多国家应用于药物和功能性食品中［1－3］。目前乳果糖的生产有化学合成与生物转化两种。化学合成主要是用碱液处理将乳糖异构化，其缺点在于生产过程中产生的有色副产物难以去除，造成分离纯化成本高，而且碱液对乳果糖的降解降低了产量［4－6］。生物转化法利用全细胞或者纯化的酶，催化底物乳糖和果糖合成乳果糖，目前使用的商用乳果糖合成酶主要是来自乳酸克鲁维酵母的β－半乳糖苷酶，但在用该酶合成乳果糖的过程中夹杂了其他低聚糖的生成［7］。本实验室曾报道了从自然分离得到的节杆菌Athrobacter sp.具有专一合成乳果糖的能力［8］，但是作为原始出发菌株，酶活水平较低，需要进行改造，并配合适宜的产酶条件，以提高产酶量。为此本文采用紫外诱变处理，筛选酶活性提高的突变株，并通过培养基优化，进一步提高产酶水平。

表2 正突变菌株的β－半乳糖苷酶活水平及酶活提高率

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

节杆菌Arthrobacter sp. 由本实验室筛选得到;固体培养基(g/L) NaCl 5、酵母膏5、蛋白胨10、琼脂20;液体培养基(g/L) 乳糖20、酵母膏5、蛋白胨10;筛选培养基(g/L) 乳糖20、酵母膏5、蛋白胨10、X－gal 0.3、琼脂20;酵母膏、蛋白胨 国药集团化学试剂有限公司，生物试剂;邻硝基苯－β－D－半乳糖苷(ONPG)、X－gal 上海生物工程有限公司，分析纯。

超声破碎仪 Ultrasonic Processor，美国;Unico UV－2100紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;TGL－16G台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂;旋转式恒温摇瓶柜 上海苏坤实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 β－半乳糖苷酶酶活测定 将固体培养基上的Arthrobacter sp.接种于液体培养基中，30℃、200 r/m in振荡培养18h，离心收集菌体，菌体重悬于50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，超声破碎、离心制成粗酶液。在试管中加入 2.5m L、100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，37℃恒温水浴预热后，加入粗酶液和ONPG，37℃反应10m in，加入 1mol/L Na2CO3溶液终止反应，测定420nm处的吸光值。采用国际酶活单位，规定1min催化ONPG水解生成1μmoL邻硝基酚的酶量为一个酶活单位(U)。

1.2.2 紫外诱变方法 将生长至对数期的菌液，离心收集菌体，加入无菌生理盐水离心洗涤2次后，转入装有灭菌玻璃珠的三角瓶内振荡，打散菌体，并调整细胞浓度至108/m L。取5m L菌液加到直径9cm的培养皿内，置于15W紫外灯下，距离30cm，分别照射 30、60、90、120、150s，取未照射的菌液和照射的菌液各0.5m L进行梯度稀释，涂布于固体培养基上，30℃避光培养72h，计算致死率。选择致死率为70%的照射时间进行紫外照射，取照射后的菌液2m L置于液体培养基中(250m L摇瓶，装液量为25m L)，30℃下120 r/m in振荡培养5h，稀释涂布于筛选培养基上，30℃避光培养72h，挑选深蓝色的菌落，摇瓶培养，测定酶活水平。

1.2.3 正交实验 选择影响产酶的4个主要因素(表1)，根据L9(34)正交实验因素水平表配制9种液体培养基，接种，30℃下200 r/m in振荡培养18h，测定酶活。

表1 正交实验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 紫外照射致死率

由图1可知，随着紫外照射时间的延长，致死率增加，照射时间为60s时致死率达到70%，将该剂量作为紫外诱变最适剂量。

图1 紫外照射的致死率曲线

2.2 突变株筛选

利用β－半乳糖苷酶分解X－gal使其变为蓝色的特点，从平板上挑取深蓝色菌落，进行摇瓶培养，破碎细胞，测定β－半乳糖苷酶酶活。表2列出了产酶水平明显提高的8株菌的酶活水平，并与出发菌株进行了比较，其中M2酶活提高最大，产酶水平较出发株提高了89%，遗传稳定性实验表明该突变株连续传代5次，酶活水平基本稳定(表3)。

表3 突变株M2的遗传稳定性

2.3 培养基成分及pH对产酶水平的影响

2.3.1 碳源的影响 碳源不仅影响到微生物的生长，而且关系到酶的诱导与表达。为此，本文选取了1%单糖(葡萄糖、半乳糖)、双糖(乳糖、果糖和蔗糖)以及多糖(糊精)为碳源，考察其对β－半乳糖苷酶的影响，培养基中的其他成分为酵母膏0.5%、蛋白胨1%，以酶活性最高者为100%，结果表明，在没有乳糖诱导物存在的条件下，Arthrobacter sp.M2的β－半乳糖苷酶为低水平组成型表达，乳糖能够促进其合成(图2)。进一步的研究表明，乳糖的适宜浓度为1%。

2.3.2 氮源的影响 氮源作为发酵培养基中的一个主要元素，对菌体的生长和产酶发挥着重要的作用。本文以1%乳糖为碳源，考察了1%的蛋白胨、酵母膏、玉米浆、NH4Cl、尿素、(NH4)2SO4对产酶的影响，结果表明玉米浆为适宜的氮源(图3)。进一步的研

图3 氮源对Arthrobacter sp.M2发酵产酶的影响

2.3.3 培养基初始pH的影响 培养基中的pH关系到细胞膜所带电荷，从而影响细胞对营养物质的吸收及产物的分泌。在本文所考察的pH范围内，Arthrobacter sp.M2产酶的适宜pH为7.0(图4)。

图2 碳源对Arthrobacter sp.M2发酵产酶的影响究表明，玉米浆的适宜浓度为2%。

图4 培养基初始pH对Arthrobacter sp.M2发酵产酶的影响

2.3.4 发酵培养基的优化 在对培养基碳、氮源、初始pH研究的基础上，结合三价铁离子对β－半乳糖苷酶的促进作用，采用L9(34)正交实验因素水平表，设计了9组实验，优化M2产酶培养基，结果如表4所示。极差分析表明，各因素对酶活的影响程度依次为A＞D＞C＞B，即乳糖浓度对Arthrobacter sp.M2发酵产β－半乳糖苷酶的影响最大，其次为初始pH和Fe3+浓度，玉米浆浓度对其影响较小。A2B3C2D2为最优水平组合，即乳糖浓度为10g/L，玉米浆浓度为22g/L，Fe3+浓度为1.5mmol/L，初始 pH 为7。由于正交实验中不包含该组合，进一步做验证实验表明，酶活达到1.875U/m L，因此该培养基为最佳实验组合。

3 结论

3.1 以具有转苷活力的节杆菌为出发菌株，经过紫外线照射，用致死率达到70%的照射时间处理细胞，在含有X－gal的筛选培养基上，筛选深蓝色突变株，进行摇瓶培养，得到8株酶活水平显著提高的菌株，其中产酶能力最强的Arthrobacter sp.M2酶活力较出发菌株提高了89%，连续传代5次，稳定性良好。

表4 正交实验结果表

3.2 比较碳源、氮源对Arthrobacter sp.M2产酶影响，结果表明乳糖、玉米浆对产酶有利，进一步的正交优化得到最佳培养基为:乳糖浓度10g/L，玉米浆浓度22g/L，Fe3+浓度1.5mmol/L，初始 pH7。

3.3 紫外诱变结合培养基优化有效地提高了节杆菌产β－半乳糖苷酶的水平。

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［8］钟义华，唐蕾，吴亢，等.具有β－半乳糖苷酶转苷能力的菌株筛选及鉴定［J］，食品与生物技术学报，2008，27(5):47－49.

Mutagenesis，screening and medium optimization for the production enhancement ofβ－galactosidase from Arthrobacter

TANG Lei1，DONG Xiao－xuan1，LIZhen－ai1，SUN Hui－hui1，YANG Rui－jin2，MAO Zhong－gui1，*
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China;
2.School of Food Science ＆ Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

The enzymatic synthesis of lactulose needs the β － galactosidase with both hydolysis and transgalactosylation activities as catalyst.Improving the productivity of such kind of enzyme is necessary. Naturally isolated Arthrobacter sp. was mutated with ultraviolent radiation. The mutants with higher β － galactosidase productivities were obtained by the screening on the selective medium with 5－bromo－4－chloro－3－indolyl－β－Dgalactopyranoside(X－ gal) as indicator and then by the liquid fermentation. The productivity of the best mutant Arthrobacter sp.M2 was 89% higher than the wild type.The optimum medium for the β－galactosidase production determined through orthogonal test was lactose 10g /L，corn syrup 22g/L，Fe3+1.5mm ol/L.The productivity was futher increased 113%using the optimized medium.Ultraviolet mutagenesis combined with medium optimization improved the productivity ofβ－galac tosidase from Arthrobacter effectively.

Arthrobacter sp.;ultraviolet mutagenesis;β－galac tosidase

TS201.3

A

1002－0306(2011)07－0192－03

2010－06－22 *通讯联系人

唐蕾(1966－)，女，博士，副教授，研究方向:发酵工程。

国家863探索项目(2006AA10Z336)。