根癌农杆菌介导水稻香味基因的遗传转化

吴 娟，徐 全，韩 静，孙婷婷，杨 芳，马长江，魏和平

(安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆 246011)

根癌农杆菌介导水稻香味基因的遗传转化

吴 娟，徐 全，韩 静，孙婷婷，杨 芳，马长江，魏和平

(安庆师范学院生命科学学院，安徽安庆 246011)

以日本腈为材料，研究根癌农杆菌介导水稻香味基因的遗传转化。研究结果表明，通过农杆菌介导的方法将水稻香味基因badh2导入了水稻粳稻品种日本腈中，并获得转基因植株。通过PCR检测，初步证明外源基因badh2已整合到日本腈基因组中。

根癌农杆菌，水稻，香味基因，遗传转化

随着人们生活水平的提高，消费者对稻米品质的要求越来越高。香米具有特殊的香味，广泛受到市场和消费者的亲睐，其销售价格往往比普通大米要高出许多。由于香米在市场上的地位，各国育种工作者一直十分重视香米品种的选育［1］。随着水稻的遗传育种研究的不断深入和水稻基因组测序工作的完成，人们开始利用转基因技术来获得水稻优良品种［2］。目前，广泛采用的基因改造方法是根癌农杆菌介导的遗传转化体系［3－4］。以根癌农杆菌介导的水稻转化方法已比较成熟，转化效率亦能满足研究需要，如Chan［5］等以农杆菌介导的方法转化水稻，成功地获得了转基因植株;Hiei［6］等首先实现粳稻的高效转化，并于1996年同时获得籼稻的转化植株，实现了籼稻群体的高效转化［7］。尽管农杆菌介导水稻转化技术已比较成熟，但是利用农杆菌介导转化水稻香味基因的研究，目前无一报道。本研究拟利用农杆菌介导转化水稻香味基因，以期获得转基因水稻植株。通过农杆菌介导的基因遗传转化，尝试将水稻香味基因转入非香水稻品种，以建立优化的水稻遗传转化体系，拓宽香稻育种的遗传背景，选育出高产稳产、香味浓郁的优质香米品种，以满足国内外市场的需求。

1 材料与方法

1.1 实验材料

根癌农杆菌EHA105 高致癌性农杆菌菌株，植物表达载体pCAMBIA1302－badh2(含卡那霉素抗性基因)，均由安庆师范学院生命科学院细胞与遗传实验室保存和提供，电击法转化农杆菌EHA105，阳性克隆经PCR鉴定后用于水稻转化;受体材料 粳稻品种日本腈成熟胚或诱导的愈伤组织。

1.2 实验方法

1.2.1 水稻愈伤组织的诱导［8］水稻种子去壳，第1次用加吐温20(1滴每50m L溶液)的2.5%NaClO溶液浸泡15min，无菌水清洗5次;第2次用不加吐温的2.5%NaClO灭菌15min，无菌水洗净后平置诱导培养基上，32℃、24h光照条件下诱导愈伤组织。

1.2.2 根癌农杆菌的电击转化［9］将根癌农杆菌EHA105单菌落接入5m L YM培养基中，28℃振荡培养过夜，8000 r/m in离心10m in，收集菌体，用预冷的无菌双蒸水洗涤4次，用无菌预冷10%的甘油洗涤，离心，再用1m L无菌预冷的10%甘油重悬菌体，取200μL菌悬液置于1.5m L离心管中，再加入5μL质粒DNA，混匀并转移至无菌预冷的电击杯中(电极间距为0.1cm)，吸干电击杯表面的水，将电击杯放入电转化仪的电极之间，在高压11kV/cm下电击5ms，取出电击杯，迅速加入1m L YM液体培养基，混匀并转移细胞至1.5m L的离心管中，在28℃摇荡孵育3h，取适量菌液涂布选择培养基，28℃培养，观察转化子。

1.2.3 农杆菌浸染愈伤组织［8］经活化培养后的含目标基因的农杆菌重悬于AAM液体培养基，并调OD600至0.1，选取生长状况良好且一致的8d龄的愈伤组织置于农杆菌菌液中浸泡5m in，然后在25℃、黑暗条件下共培养3d;共培养后用含0.5g/L羧苄青霉素的无菌水清洗5次共30m in，转入筛选培养基，32℃、24h光照条件下培养14d;直接将新生的抗性愈伤组织移入再生培养基进行分化培养，条件为22℃、16h光照，当再生芽长到2cm左右时进行生根培养。

1.2.4 转化体的获得 新鲜愈伤组织将有绿点出现，每2周继代一次，待分化出完整小苗后转入壮苗培养基MS中，炼苗并移栽。

1.2.5 转基因个体的检测 生根后炼苗时取少量叶片，提取水稻总DNA。根据badh2［10］基因的5'和3'端序列设计一对引物，P1:5'GGTTGCATTTACTGGGAGTT'和P2:5'CAGTGAAACAGGCTGTCAAG'。PCR扩增条件:94℃预变性 5m in;94℃ 45s，56℃ 90s，72℃ 90s，35个循环，72℃延伸10m in。PCR扩增体系:取DNA模板 1μL，10 倍 PCR 缓冲液 2μL，引物 2μL，dNTPs 2μL，Taq DNA 聚合酶 0.5μL，总反应体积为 20μL。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，鉴定基因组中是否转入目的基因。

2 结果与分析

2.1 根癌农杆菌Ti质粒介导转化及阳性转化子的筛选

将根癌农杆菌EHA105 200μL菌悬液于1.5m L离心管，加5μL质粒DNA于菌液中，混匀并转移至无菌预冷的电击杯中(电极间距为0.1cm)，在11kV/cm电压下电击5ms，然后取适量菌液涂布选择培养基，观察并筛选阳性转化子(见图1)。

图1 阳性转化子的筛选

根癌农杆菌悬液在11kV/cm的瞬间高压下，细胞膜两端会产生一个电位，一旦细胞膜上所产生的电位超过一定限度时，膜会局部破裂，从而导致外源DNA进入细胞。图1是电击转化后细菌质粒DNA在经PCR、琼脂糖凝胶电泳后的检测图，图中“阳性转化子”是在引物1、2引导下经PCR扩增的badh2基因的一段260bp左右的DNA片段。由图1可知，通过根癌农杆菌介导电击转化，已获得阳性转化子(见图1)，即证明badh2基因表达载体已成功地转化到EHA105中。

2.2 水稻愈伤组织的诱导及根癌农杆菌的浸染

水稻种子去壳，第1次用加吐温20(1滴每50m L溶液)的2.5%NaClO溶液浸泡15min，无菌水清洗5次;第2次用不加吐温的2.5%NaClO灭菌15m in，无菌水洗净后平置诱导培养基上，32℃、24h光照条件下诱导愈伤组织(见图2)。

图2 水稻的愈伤组织和转化幼苗

经活化培养后的含目标基因的农杆菌重悬于AAM液体培养基，并调OD600至0.1，选取生长状况良好且一致的8d龄的愈伤组织置于农杆菌菌液中浸泡5m in，然后在25℃、黑暗条件下共培养3d;共培养后用含0.5g/L羧苄青霉素的无菌水清洗5次共30m in，转入筛选培养基，32℃、24h光照条件下培养14d;直接将新生的抗性愈伤组织移入再生培养基进行分化培养，条件为22℃、16h光照，当再生芽长到2cm左右时进行生根培养。

2.3 转基因个体的检测

生根后炼苗时取少量叶片，提取水稻总DNA。DNA提取方法按照吴娟［11］“水稻基因组DNA微量提取”方法进行，然后以水稻总DNA为模板，在badh2基因内部1对引物的引导下，PCR扩增badh2基因的特异性序列后，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。

图3 转基因个体的检测

由图3可知，以根癌农杆菌介导转化水稻香味基因badh2，已获得转基因个体。图3中植株个体编号2、3、4等均已扩增出水稻香味基因的特异性片段，即证明香味基因badh2已成功转入水稻植物内。

3 讨论

随着基因工程技术的不断发展和完善，基因转化成为近年来国内外科研工作者的研究热点，它不仅有利于培育高产、优质、抗病虫害和抗逆境等具有多个优良性状的作物品种［12］，可以通过后代分离获得无选择标记的转基因植株，克服转基因安全性的问题，更为进行多基因控制的生化代谢途径的研究开辟了新的领域［13］。

本研究利用农杆菌介导法对水稻香味基因转化系统进行了研究，以日本腈成熟种子为材料，以8d龄愈伤组织浸染5m in，以普通琼脂作为凝固剂在40d左右就得到了阳性的T0代水稻植株，有目的地将香味基因快速导入日本腈水稻亲本中，为培育优良水稻品种和遗传育种工作奠定了一定实验基础，且建立的优化的水稻遗传转化体系，拓宽了香稻育种的遗传背景，选育出高产稳产、香味浓郁的优质香米品种，以满足国内外市场的需求。

［1］王军，杨杰，陈志德，等.水稻香米基因标记的开发与应用［J］.分子植物育种，2008，6(6):1209－1212.

［2］王丰，李金华，柳武革，等.一种水稻香味基因功能标记的开发［J］.中国水稻科学，2008，22(4):347－352.

［3］郑杰.农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究［J］.湖南农业科学，2008(2):6－7.

［4］汪秀志，张红宇，汪旭东，等.农杆菌介导的水稻双基因共转化初步研究［J］.核农学报，2009，23(1):28－32.

［5］Chan mT，Chang H H，Ho S L，et al.Agrobacterium－mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric co－amylasepromoter/β－glucuronidase gene［J］.Plant Mol Boil，1993，22，491－506.

［6］Hiei Y，Ohta S，Komari T，etal.Efficient transformation of rice mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T－DNA［J］.Plant J，1994，6(2):271－282.

［7］Hiei Y，Komari T.Improved protocols for transformation of indicaricemediated by Agrobacterium tumefaciens［J］.Plant Cell Tiss Org Cult，2006，85:271－283.

［8］苏益，黄善金，蔺万煌，等.根癌农杆菌介导的水稻快速转化方法研究［J］.中国农学通报，2008，24(5):83－86.

［9］匡小婴，饶志明，沈微，等.影响根癌农杆菌的电击转化条件［J］.食品与生物技术学报，2005，24(4):13－16.

［10］史薇薇.水稻米香基因标签标记的开发与利用［D］.扬州大学硕士学位论文，2007.

［11］吴娟，吴金平.水稻基因组DNA微量提取［J］.生物学杂志，2007，24(4):55－57.

［12］胡亚军，刘雄伦，江南，等.水稻OsSAMT1基因的克隆及其遗传转化［J］.湖南农业大学学报:自然科学版，2009，35(4):4362－365.

［13］丁盛，刘清，黄志刚，等.反义 Waxy基因转化籼稻9311的初步研究［J］.湖南农业大学学报:自然科学版，2009，35(4):366－368.

Genetic transformation mediated by agrobacterium with fragrant gene in rice

WU Juan，XU Quan，HAN Jing，SUN Ting－ting，YANG Fang，MA Chang－jiang，WEIHe－ping
(Anqing Teachers’College，Life Science School，Anqing 246011，China)

Rice variety nipponbar was tested as experimental materials.By agrobacterium－mediated method，rice aroma gene will be transformed into nipponbar.The results showed that in this method，fragrant gene badh2 in rice was triumphantly transformed into nipponbar and transgenic plants were obtained. By PCR testing，the result indicated that the foreign gene badh2 had been integrated into the genome of the nipponbar.

agrobacterium;rice;fragrant gene;genetic transformation

TS201.1

A

1002－0306(2011)07－0195－03

2010－06－17

吴娟(1980－)，女，硕士，讲师，主要从事遗传学教学和科研工作。

安徽省教育厅自然科学研究项目(KJ2009B085);安庆市科技局重点科技项目(20090616);安庆师范学院2010年青年科研基金(KJ201014)。