微射流均质结合非淀粉酶处理法对大米蛋白-淀粉复合体分离效果的研究

龚 倩，杨晓泉，*，夏 宁，万 娟，陈嘉东

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640;

2.广东省粮食科学研究所，广东广州 510050)

微射流均质结合非淀粉酶处理法对大米蛋白-淀粉复合体分离效果的研究

龚 倩1，杨晓泉1，*，夏 宁1，万 娟2，陈嘉东2

(1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640;

2.广东省粮食科学研究所，广东广州 510050)

采用微射流处理结合非淀粉酶处理对碎米中蛋白质－淀粉复合物进行解聚处理，并研究所获得蛋白质及淀粉产品的性质。结果表明:此方法能够有效分离碎米中蛋白质及淀粉;获得的蛋白质与碱法提取的蛋白质相比，更具天然性;淀粉产品比碱法提取的淀粉有更低的峰值温度及更高的峰值粘度。由此可见，微射流结合非淀粉酶处理是高效分离碎米中蛋白质及淀粉，并获得高品质产品的一种有效途径。

微射流均质，碎米，蛋白质，淀粉

碎米是大米加工中不可避免的副产物，但目前并未得到合理有效的利用。碎米的主要成分是80%左右的淀粉及8%左右的蛋白质［1］，与整米无异，但售价低廉，是用于提取大米蛋白及淀粉的优质原料。大米胚乳内部结构紧密，淀粉颗粒细小，并且几乎全部以复粒形式存在;蛋白质以两种蛋白体形式存在，即PB－I和PB－II两种类型，并且与淀粉颗粒包络紧密［2］。胚乳中超过80%的蛋白质是谷蛋白，分子内和分子之间广泛存在的二硫键以及分子内存在的巯基，决定其不溶于中性盐溶液而只溶于稀酸、稀碱，给大米蛋白的分离也带来困难［3］。目前常用的方法有碱浸法［4－5］、溶剂法［6］及酶法［7］。其中，在高碱的条件下，蛋白质会发生一系列的不良反应而产生有毒物质，产品不适合人类食用，只能用作动物饲料;溶剂法可能导致萃取溶剂在产品中的残留，存在食品安全隐患;而蛋白酶的处理，通常会导致苦味肽的生成，产品风味不佳;淀粉酶处理则破坏其中的淀粉，不能同时获得淀粉产品。Guraya等人报道利用微射流均质的方法破坏淀粉－蛋白质复合体，高效的同时获得两种产品，但存在的主要问题是蛋白质产品的纯度不高［8］。本课题的研究目的在于采取微射流均质法，并在非淀粉酶的辅助作用下，解聚碎米中淀粉－蛋白质复合体，使蛋白质与淀粉组分发生分离，并通过进一步的分离纯化，得到高纯度的蛋白质产品及低蛋白质残留的淀粉产品。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

碎米 广东省粮食科学研究所提供，粉碎60目备用，蛋白质含量7.12%;果胶酶、纤维素酶、戊聚糖酶、α－淀粉酶、糖化酶 丹麦诺维信公司;其他试剂 均为分析纯。

中试型胶体磨 德国IKA公司;M2110EH微射流纳米均质机 美国Microfluidics公司;CR22G冷冻离心机 日本Hitachi公司;Rapid N Cube快速定氮仪 德国Elementar公司;Q100差示扫描量热仪 美国TA Instruments公司;Mastersize2000粒度分布仪英国Malvern公司;布拉班德粘度仪 德国Brabender公司。

1.2 实验方法

1.2.1 碱浸法分离 在室温下将碎米粉浸泡在0.1%的NaOH溶液中，放置18h。离心处理，结束后收集沉淀为大米淀粉，烘干备用，并用1mol/L的HCl溶液沉降上清液中蛋白质，冻干备用。

1.2.2 微射流均质结合酶处理法分离 室温下将碎米粉浸没于一定比例的去离子水中浸泡30m in，后倒入胶体磨进一步湿法磨浆至120目。将米浆倒入微射流均质机的进料筒内，均质一定次数后，收集碎米乳液，向其中添加果胶酶、纤维素酶、戊聚糖酶等，反应一定时间后，调节pH至10.0灭酶。将米乳液离心处理，结束后收集上清液、中间层及沉淀层，用于下一步实验。利用α－淀粉酶及糖化酶对中间层处理，获得纯度较高的大米蛋白。

1.2.3 蛋白质含量及分布测定 本实验中蛋白质含量的测定均采用GB5009.5－2010燃烧法，大米蛋白的蛋白因子为 5.95［8］。

1.2.4 蛋白质热性质分析 称取2.0mg蛋白样品于铝盒，吸取10μL去离子水浸润样品，压盘。以空白盘做对照，温度扫描范围:25～95℃;升温速率:10℃/m in;保护气氮气流速:50m L/m in。采用 The Universal Analyzer 2000软件计算蛋白质的变性起始温度(Tm)、变性温度(Td)、半峰宽(ΔT1/2)和变性焓变(ΔH)。

1.2.5 粒径分布 将100mg待测样品溶解于5m L去离子水中，振荡10m in使样品颗粒分散均匀。采用Mastersizer2000粒径分布仪测定。按照仪器提示加入所需量的样品数滴，样品加入后在仪器中进行分散，分散剂为水，在转速为1800 r/m in的条件下测定，得粒径体积分布图。

1.2.6 布拉班德粘度曲线分析 准确配制6.0%淀粉糊(以干基计)，倒入布拉班德粘度测定仪专用的圆筒形铝盒中。测定条件:从30℃开始计时，以1.5℃/min的速度上升到95℃;95℃下保持30m in;以1.5℃/m in下降到50℃;50℃下保持30m in。糊化过程中搅拌器的速度保持在160 r/min。

2 结果与讨论

2.1 微射流均质处理对碎米蛋白在不同组分中的分布及含量的影响

微射流高压均质可以破碎碎米胚乳细胞壁，使细胞破碎，且使碎米胚乳中紧密结合的蛋白质－淀粉复合体发生松团作用，使蛋白质游离而与淀粉分离。继而通过离心分级，可使具有不同密度的样品逐步分离，富集于不同的组分中。其中，受限于碎米蛋白的较差的溶解性，仅极少量的蛋白质溶解于上清液中;游离出的蛋白质组分主要富集在中间层;淀粉组分及未发生分离或部分分离的蛋白质－淀粉复合体主要集中在残渣层。

本实验中，不同程度的均质处理工艺对各组分中蛋白质分布的影响如图1所示。其结果表明，作为对照的未处理的样品经过离心后，蛋白质主要集中在沉淀层中(回收率高达92.18%)，而上清液及中间层的蛋白质分布很少，并且沉淀层中的蛋白质含量(7.12%)与原料相比几乎没有改变，由此可见样品中几乎未发生蛋白质与淀粉组分的分离。经过胶体磨处理后，上清液和中间层的蛋白质分布明显增多，蛋白质集中于中间层(回收率63.79%)，且沉淀层的残余蛋白含量降低至2.32%，由此可见该处理能促进碎米中蛋白质的游离，并使蛋白质富集于中间层。进一步的高压均质处理对蛋白质在不同组分中的分布也有重要影响:随着均质次数的增多，上清液中蛋白质含量及回收率呈现出先降低后升高的趋势;在中间层，蛋白纯度随均质次数增多而增大，而回收率呈现先升高后降低;沉淀层中，蛋白质纯度及回收率呈先降低后升高的趋势。由此可见，高压均质能有效促进蛋白质与淀粉的分离，但过多的均质次数，能使部分蛋白质重新复合而沉降，导致分离效果的弱化。尤其是微射流均质2次处理后，中间层的蛋白回收率(72.89%)最高，且残渣层残余蛋白含量(1.29%)最低。据此认为，微射流均质2次处理对碎米蛋白－淀粉复合体的分离效果最好。

图1 微射流均质处理对碎米蛋白在不同组分中的分布的影响

2.2 不同微射流均质处理程度对淀粉粒径的影响

碎米淀粉颗粒的粒径较小，均值为2～8μm，绝大多数在10μm以内;而未与蛋白质完全分离的蛋白－淀粉复合体则呈现出更大的粒径值。因此，可以用淀粉的粒径分布来衡量不同处理方法对碎米淀粉及蛋白质的分离程度。图2为不同微射流均质程度的淀粉样品的粒径分布曲线，结果表明，未处理样品的粒径分布主要集中在100～200μm范围内，而在10μm附近处有一个更微弱的峰，说明未处理的样品只有极少部分发生了淀粉－蛋白质复合体的解聚;胶体磨处理后，颗粒粒径分布前移，更多的集中在10～20μm处，且在100～200μm范围的分布减少;微射流均质处理后，粒径分布继续前移，第一个峰值出现在10μm，同时在100～200μm处仍存在明显峰形。这表明，均质处理后，碎米淀粉易于离散，但仍有部分淀粉颗粒以复粒或淀粉－蛋白复合体的形态存在。

图2 不同微射流均质处理的淀粉样品的粒径分布曲线

2.3 微射流均质结合酶法处理对蛋白质分布及含量的影响

在本实验中，选取微射流均质2次为均质处理分离碎米蛋白的最佳条件。在此基础上，研究结合果胶酶、纤维素酶、戊聚糖酶等单一酶处理及三种酶共混使用对其分离效果的影响。图3为微射流均质结合酶法处理后各组分中的蛋白质分布及含量，以未处理样品做为对照。研究结果表明，在微射流均质2次的基础上，使用酶处理可以进一步强化分离效果:相较于对照样，在蛋白质富集的中间层中，蛋白质的回收率有很大的提高，尤其是三种酶制剂复合使用时，回收率从5.03% 提升至81.87%，蛋白质纯度45.00%;在淀粉富集的残渣层中，蛋白质含量均得到不同程度的降低，戊聚糖酶的添加使残渣层蛋白含量降低至0.96%，使用复合酶后残渣层中蛋白质含量为1.10%。

图3 酶法辅助微射流均质处理对蛋白质分布的影响

综合上述结果，本实验选取微射流均质2次结合复合酶制剂所得样品进行下一步研究。定义其残渣层为均质法－淀粉，其残余蛋白含量1.10%，略低于碱法－淀粉(残余蛋白含量2.04%);并利用α－淀粉酶与淀粉糖化酶共同处理去除中间层的淀粉杂质，获得进一步纯化的蛋白样品(纯度87.89%)，定义为均质法－蛋白，其蛋白质纯度略高于碱法－蛋白(纯度81.12%)。

2.4 蛋白质热性质分析

利用差示扫描量热仪测定碱法－蛋白与均质法－蛋白的热学特性，其扫描曲线如图4所示。均质法－蛋白样品的DSC谱图呈现出一个单一的吸热峰(Td=66.46℃)，这归结于均质法－蛋白样品的变性;而碱法－蛋白样品的DSC曲线上没有明显的吸热峰，反而呈现为平直曲线。这表明，经过碱液浸泡处理所提取的蛋白质发生变性，未能出现米蛋白的特征峰。即相较于碱法－蛋白样品，均质法－蛋白样品更接近天然蛋白。

图4 碎米蛋白的DSC扫描曲线

2.5 布拉班德粘度曲线

布拉班德粘度仪可用于评价淀粉的糊化性质:淀粉乳在升温过程中，颗粒缓慢膨胀。当达到淀粉的糊化温度时，淀粉便大量吸收水分而溶胀成淀粉糊，使体系的粘度快速增大。继续保温、降温、保温，淀粉糊粘度会随之发生一系列变化。碱法－淀粉及均质法－淀粉的布拉班德粘度曲线如图5所示。实验结果表明，与碱法－淀粉样品相比，均质法－淀粉具有更低的起始糊化温度，更早到达峰值温度，且具有更高的峰值粘度，这与均质法破坏了淀粉颗粒与蛋白体的结合有关，使得均质法－淀粉更易吸水膨胀;此外均质法－淀粉的最终粘度显著高于碱法－淀粉，这是由于前者样品中残余的蛋白质含量更低。

图5 碱法－淀粉及均质法－淀粉样品的布拉班德粘度曲线

3 结论

利用微射流均质可以有效地破坏碎米中淀粉－蛋白质复合体，达到二者的有效分离;辅助以果胶酶、纤维素酶、戊聚糖酶等后，分离效果更佳，在中间层的蛋白回收率高达81.87%，获得淀粉样品的蛋白质残余仅为1.10%。淀粉粒度分布的分析表明，微射流均质处理能导致解聚淀粉－蛋白质复合体，获得微细化的大米淀粉颗粒，且使碎米中蛋白质及淀粉易于分离。此外，对碱法及均质法样品进行对比分析，DSC的分析结果表明与碱法－蛋白相比，均质法－蛋白的热性质及结构更接近天然碎米蛋白;布拉班德粘度曲线结果表明与碱法－淀粉相比，均质法－淀粉具有更低的起始糊化温度，更早到达峰值温度，且具有更高的峰值粘度及最终粘度。由此可见，微射流结合非淀粉酶处理是高效分离碎米中蛋白质及淀粉，并获得高品质产品的一种有效途径。

［1］Cagampang GB，Cruz LJ，Espiritu SG，et al.Studies on the extracion and composition of rice proteins［J］.Cereal Chemistry，1966，43(2):145－155.

［2］Champagne E，Wood D，Bienvenido J，et al.The rice grain and its gross composition.In Rice Chemistry and Technology［M］.St Paul MN:American Association of Cereal Chemists，2004:77－108.

［3］Zarins Z，Chrastil J.Separation and Purification of Rice Oryzenin Subunits by Anion－Exchange and Gel－Permeation Chromatography［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40:1599－1601.

［4］Yamamoto K，Sawada S，Onogaki T.Properties of rice starch prepared by alkali method with various conditions［J］.Denpun Kagaku，1973，20:99－102.

［5］Zhao Y.Rice protein extraction and rice starch making method using rice asmaterial［P］.CN1557178－A，2005.

［6］Lim，ST，Lee JH，Shin DH，et al.Comparison of protein extraction solutions for rice starch isolation and effects of residual protein content on starch pasting properties［J］.Starch－Starke，1999，51(4):120－125.

［7］Lumdubwong N，Seib PA.Rice starch isolation by alkaline protease digestion of wet－milled rice flour［J］.Journal of Cereal Science，2000，31(1):63－74.

［8］Guraya HS，James C.Deagglomeration of rice starch－protein aggregates by high－pressure homogenization［J］.Starch－Starke，2002，54(3－4):108－116.

Study on separation of rice protein－starch aggregates by microfluidization homogenization combined with non－amplyse carbohydrases

GONG Qian1，YANG Xiao－quan1，*，XIA Ning1，WAN Juan2，CHEN Jia－dong2

(1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China;2.Guangdong Institute of Cereal Science Research，Guangzhou 510050，China)

Microfluid ization homogenization assisted with none－amylase carbohydrases treatment were used to wreck starch－protein aggregates in broken rice，then the samples were analyzed.The results showed that:the method was effective in separating protein and starch in broken rice，meanwhile，compared with alkali method，the protein extracted was more native，and starch extracted owns lower beginning of gelatinization temperature，higher viscosity values.Hence，microfluidization homogenization assisted with none－amylase carbohydrases treatment was considered as a kind of method，which separated protein and starch effectively in broken rice，with attaining high quality samples.

microfluidization homogenization;broken rice;protein;starch

TS210.1

A

1002－0306(2011)07－0119－04

2010－07－19 *通讯联系人

龚倩(1988－)，女，硕士研究生，研究方向:植物蛋白质工程。

广东省重大科技专项产业共性技术项目(2009A080209001)。