面包酵母海藻糖含量与酵母耐性之间的关系

陈丽君，肖冬光，郭学武，张翠英，盖伟东

(工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

面包酵母海藻糖含量与酵母耐性之间的关系

陈丽君，肖冬光*，郭学武，张翠英，盖伟东

(工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

以存活率为指标，探讨了不同时期不同面包酵母的耐盐性能、耐酒精性能、耐高温性能以及耐冷冻性能，并且测定了不同时期菌体胞内海藻糖含量，研究结果表明胞内海藻糖含量与酵母的耐受性之间存在一定的相关性，海藻糖含量越高，酵母的耐性越好。

面包酵母，海藻糖，耐性，耐冻性，存活率

面包酵母在微生物分类学上属于酵母属、酿酒酵母种(Saccharomyces cerevisiae)，是面包生产过程中最重要的微生物发酵剂和生物疏松剂，在面包生产中起着关键作用［1］。酵母耐性一般是指耐酒精性、耐高温性、耐盐性以及耐冷冻性，它已成为工业生产、育种等方面的一个重要指标。海藻糖是生物体内的一种典型的应激代谢物，被人称为“生命之糖”，研究表明酵母耐性与菌体胞内海藻糖含量存在着一定的关系［2－6］。许多生物在胁迫环境(如高温、冷冻、高渗等)下表现出的抗逆耐受力与体内的海藻糖含量有直接的关系，生物体可以通过促进海藻糖的合成来抵御外界的不良伤害，所以胞内海藻糖含量被认为是酵母耐性的重要鉴定指标［7－9］。但是胞内海藻糖含量与酵母耐性之间存在一种怎样的关系还并没有统一的定论，因此酵母耐性与海藻糖含量之间的关系有待于进一步研究。本工作首先确定了酵母存活率的测定方法，在此基础上测定了不同时期、不同面包酵母菌株的耐性和菌体胞内海藻糖含量，探讨了酵母耐性与胞内海藻糖含量之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

面包酵母菌株 实验室保存，标号分别为BY－6、BY－12、BY－14、A6、B6、BY－24;YEPD 培养基 葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH5.0，121℃灭菌15m in;耐盐培养基 葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，NaCl 5%，121℃灭菌15m in;耐酒精培养基 葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，121℃灭菌15m in，待冷却至室温，加入15%Vol的无水乙醇。

1.2 实验方法

1.2.1 鲜酵母的制备 在30℃下，经种子培养基静置培养24h后，以10%接种量转入YEPD培养基中培养至稳定期，菌体经离心洗涤2次后收集备用。

1.2.2 细胞存活率方法的确定 取培养至对数期的菌液5m L，用无菌水离心洗涤3次后，将菌体转接于含有15%Vol酒精的YEPD培养基中，30℃、160r/min处理1h，以存活率为指标，采用亚甲基蓝染色法以及活菌计数法对菌株对数期的耐酒精性能进行测定。

1.2.3 酵母耐性实验 耐盐性实验:取培养到对数期(稳定期)的菌液5m L，用无菌水离心洗涤3次后，转接于含有 5%NaCl的 YEPD培养基中，30℃、160 r/m in处理1h，测定处理前后活菌数，计算菌体存活率。

表1 亚甲基蓝染色法测定酵母存活率

表2 活菌计数法测定酵母存活率

表3 酵母耐受性与菌体胞内海藻糖含量的关系

耐酒精实验:取培养到对数期(稳定期)的菌液5m L，用无菌水离心洗涤3次后，转接于含有15%Vol酒精的YEPD培养基中，30℃、160 r/m in处理1h，测定处理前后活菌数，计算菌体存活率。

耐高温实验:取培养到对数中期(稳定期)的菌液1m L，用无菌水离心洗涤3次后，悬浮于9m L生理盐水中，在52℃水浴锅中处理30m in，迅速冷却至室温，测定处理前后活菌数，计算菌体存活率。

耐冷冻实验:取培养到对数中期(稳定期)的菌液1m L，用无菌水离心洗涤3次后，收集菌体，放入－20℃冰箱中冷冻保存21d后，30℃解冻30min，测定冷冻前后的活菌数，计算冷冻存活率。

1.2.4 酵母胞内海藻糖含量的测定 硫酸蒽酮法，参考文献［10］。

2 结果与讨论

2.1 酵母存活率测定方法的确定

选用BY－6为测试菌株，取7个平行样，以存活率为指标，采用染色法以及活菌计数法分别对对数期菌体的耐酒精性能进行测定，结果见表1与表2。

由表1和表2可以看出，由染色法测定的酵母存活率上下偏差起伏较大，标准偏差为3.18，而活菌计数法测定的存活率数据较为一致，计算的标准偏差为0.61。由此可见，采用染色法测定的酵母细胞存活率比采用活菌计数法所测定的存活率误差大很多，可能的原因是因为染色剂与放置温度有一定的关系，另外有些细胞呈现浅蓝色，不能准确判定细胞是否死亡，所以在计数时存在很大的误差，因此在本实验中存活率的测定方法选用活菌计数法。

2.2 酵母耐性与海藻糖含量的关系

以存活率为指标，测定6株面包酵母菌株对数期和稳定期的耐受性，同时测定了6株菌株两个时期的胞内海藻糖含量，测定结果见表3。

由表3可知，6株不同的面包酵母菌株胞内海藻糖含量在稳定期普遍高于对数生长期。在对数期时，6株菌株胞内海藻糖含量都比较低，其中BY－24胞内海藻糖含量最高，但也只达到3.12%，A6胞内海藻糖含量最低，只有0.98%;进入稳定期后，6株菌株胞内海藻糖含量大大提高，含量基本都在10%以上，其中仍是 BY－24胞内海藻糖含量最高，高达17.62%，比对数期提高了5.6倍，BY－6菌株海藻糖含量最低，为9.44%，但也比对数期胞内海藻糖含量提高了9.5倍。由此可见，稳定时期菌体胞内可以大量积累海藻糖，这是因为海藻糖属于生物体内一种典型的应激代谢物，当细胞处于稳定期时，胞内开始产生代谢产物，因而此时酵母细胞内开始有大量海藻糖的积累。

从表3还可以看出，不同时期、不同面包酵母的耐性存活率也有很大差异，其中处于稳定期的酵母菌体耐性存活率比对数期菌体耐性存活率高很多。出现这一现象的原因可能是因为处于对数期的菌体生长旺盛，细胞生长易受外界环境条件的影响，细胞死亡呈现很大的随机性，因而测得的细胞存活率很低，并且极不稳定。

2.3 酵母耐性与胞内海藻糖含量相关性分析

在测定的6株面包酵母中，处于同一时期不同的面包酵母，BY－24胞内海藻糖含量最高，其各种耐性存活率最高;稳定期6株菌体各种耐性存活率趋势为BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，菌体胞内海藻糖含量趋势为BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，二者之间的关系见图1～图4。由图1～图4可以看出，菌体的耐性存活率与胞内海藻糖含量二者之间存在一定的相关性(R2＞0.85)，菌体胞内海藻糖含量越高，其耐性存活率也越高，由此可以说明，海藻糖含量的积累有助于菌体耐性存活率的提高。

图1 菌体耐酒精性能与胞内海藻糖含量之间的关系

图2 菌体耐盐性能与胞内海藻糖含量之间的关系

图3 菌体耐高温性能与胞内海藻糖含量之间的关系

图4 菌体耐冷冻性能与胞内海藻糖含量之间的关系

3 讨论

通过对6株面包酵母菌株不同时期的耐性存活率进行测定，结果表明不同的酵母菌株处于稳定期的各种耐性存活率普遍高于对数期的菌体存活率，因而说明稳定期酵母菌体耐性要比对数期菌体耐性好，在稳定期可以获得大量菌体，有相关研究也说明了这一点［12－13］。

国内外研究表明，菌体胞内海藻糖含量与菌体耐受性之间存在一定的相关性［2－6］。Sukesh［2］对酵母细胞在加盐培养基中的生长情况进行了报道，发现海藻糖含量与细胞对外界不利环境的耐受性有着密切关系。史戈峰［3］和高峻［4］等发现酵母胞内海藻糖的累积与良好的酒精发酵性能、较高的细胞存活率相关联，证明了海藻糖积累较多时对酵母细胞有一定的保护作用。Diniz－Mendes等［5］研究发现细胞经预先短时温和热处理，可增加细胞内海藻糖的积累，可以提高酵母细胞的存活率。Hino等［6］研究发现胞内海藻糖的累积与较高的冷冻存活率有着密切的关系。本文对6株面包酵母菌株稳定期的海藻糖含量测定的结果为BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，各种耐性存活率均为BY－24＞A6＞B6＞BY－14＞BY－12＞BY－6，由此可以看出胞内海藻糖含量的提高可以大大提高菌体的耐受能力，可能是因为处于稳定时期的菌体胞内会大量积累海藻糖，它赋予生物体抵抗干燥、干旱、寒冷、高温以及氧自由基等恶劣环境的能力。

到目前为止，国内外针对于酵母几种耐性与海藻糖含量的关系还没有综合性的研究，本文对酵母的耐冻性能、耐盐性能、耐酒精性能以及耐高温性能与菌体胞内海藻糖含量之间的关系进行了简单的探讨，有关酵母耐性与胞内海藻糖含量的关系还需进一步研究。这一问题的解决将会为耐性面包酵母菌的选育开辟一条新的途径，不仅可以提高我国焙烤食品行业的技术水平，同时对酵母行业的发展也有重要意义。

［1］冯薇，段绪果 .面包酵母研究进展［J］.化工时刊，2008，22(7):42－45.

［2］Sharma SC.A possible role of trehalose in osmotolerance and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae［J］.FEMS Microbiology Letters，1997，152(1):11－15.

［3］史戈峰，莫湘药.酵母酒精发酵性能及海藻糖代谢［J］.无锡轻工大学学报，1999，18(5):122－125.

［4］高峻，池振明.耐高浓度酒精酵母菌与酒精敏感酵母菌中海藻糖含量与耐酒精的关系［J］.食品与发酵工业，2001，27(5):4－7.

［5］Diniz－Mendes L，Bernardes E，de Araujo PS，et al.Preservation of frozen yeast cells by trehalose［J］.Biotechnology and Bioengineering，1999，65(5):572－578.

［6］Hino A，Mihara K，Nakashima K，et al.Trehalose levels and survival ratio of freeze－tolerant versus freeze－sensitive yeasts［J］.Applied and Environmental Micribiology，1990，56(5):1386－1391.

［7］吕烨，肖冬光，和东芹，等.酵母海藻糖酶缺失突变株的构建及其耐性［J］.微生物学报，2008，48(10):1301－1307.

［8］吕莹果，王群学，陈能飞.胞内海藻糖含量对冷冻面团中酵母抗冻性的影响［J］.四川食品与发酵，2007，43(1):1－7.

［9］张玉华，凌沛学，籍保平.海藻糖的研究现状及其应用前景［J］.食品与药品 A，2005，7(3):8－13.

［10］Ferreira JC，Paschoalin VMF，Panek AD，et al.Comparison of three different methods for trehalose determination in yeast extracts［J］.Food Chemistry，1997，60(2):251－254.

［11］细胞培养的相关操作http://blog.sina.com.cn/nnpp87.

［12］Hounsa CG，Brandt EV，Thevelein J，et al.Role of trehalose in survival of S.cerevisiae under osmotic stress［J］.Microbiology，1998，144:671－680.

［13］DE Virgilio C，De Virgilio C，Hottiger T，et al.The role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in yeast.I.Genetic evidence that trehalose is a thermoprotectant［J］.European Journal of Biochemistry，1994，219:179－186.

Correlation between the trehalose content and the stress resistance of the baker yeasts

CHEN Li－jun，XIAO Dong－guang*，GUO Xue－wu，ZHANG Cui－ying，GAI Wei－dong

(Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

The freeze－tolerance，the stress resistance and the trehalose content of different baker yeasts in the different periods was discussed.It was found that there was a correlation between the trehalose content and the stress resistance，and there was a better stress resistance with the higher trehalose content.

baker yeast;trehalose;stress resistance;freeze－tolerance;survival rate

TS201.2

A

1002－0306(2011)08－0112－04

2010－07－19 *通讯联系人

陈丽君(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:现代酿造技术。

国家科技支撑计划项目(2007BAK36B04);天津市科委自然基金重点项目(10JCZDJC16700)。