Toll样受体4与器官移植排异

赵 毅，蔡 真 综述

(浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

随着现代医学的发展，器官移植越来越多地成为了治疗恶性疾病的手段，为患者获得新生提供了机会。可是，随着器官移植手术的广泛开展，移植后主要并发症之一，移植排异极大影响了移植效果，增加了患者死亡率，阻碍了移植医学的发展。由于器官移植是人为引入外来器官，因此不可避免带来异己抗原的识别问题。其中，Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是微生物入侵后预警免疫系统必需的天然免疫受体，可对病原相关的分子模式(pathogenassociated molecular pattern，PAMP)进行识别，其与炎症和自身免疫性疾病的发生密切相关，在天然免疫防御中起重要作用［1］，此外，新近的研究表明，TLRs还参与同种异型器官移植过程中的排斥反应。本文对TLR4在器官移植排异发生过程中所起的具体作用做一综述。

1 TLR4在内毒素诱导的信号转导中起主导作用

TLR家族到目前为止共发现有13类受体，其中对由 Medzhitov［2］等人在1997年发现的TLR4分子的研究最为深入和全面。TLR4广泛表达在各种细胞表面，其既包括非特异性免疫细胞，如巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞和肥大细胞，又包括介导特异性免疫反应的T淋巴细胞和B淋巴细胞。此外，TLR4在人皮肤角质细胞、气道上皮细胞、胚肾细胞和某些小肠上皮细胞等非淋巴细胞表面也可检测到［3-5］。

随着对TLR4的分子结构、识别受体、内毒素(LPS)诱导的信号传导途径及基因缺陷型动物模型等研究的深入，TLR4在机体免疫系统中的重要性也日益显现。TLR4作为识别细菌共有成分的形态识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，在LPS诱导的信号转导中起主导作用，TLR4是识别LPS的主要受体，还能被一些内源性配体如热休克蛋白(heat shock proteins，HSP)、纤维连接蛋白 A结构域(fibronectin A domain)等活化［6］。在 TLR4 的基因上，即使仅出现一个碱基的突变，也会导致宿主对革兰阴性菌的反应能力严重丧失。TLR4基因缺失患者对LPS呈免疫耐受状态。LPS作为革兰氏阴性菌外膜成分，先与血清中脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)结合后再与CD14形成复合物，此复合物中的 LPS解聚后与 TLR4结合，导致TLR4的聚合而活化，在MD-2的辅助下，活化的TLR4通过其胞浆区Toll/IL-1受体同源区(Toll/IL-1 receptor homologous region，TIR)，与胞浆内接头蛋白MyD88(myeloid differentiation protein，髓样分化蛋白)的C-端TIR结合形成复合物，再通过MyD88的N-端死亡结构域(death domain，DD)结合 IL-1受体相关激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)，二者作用导致IRAK的自身磷酸化，从而激活肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TNF-αreceptor associated factor 6，TRAF-6)，活化的IRAK与TRAF6结合后，可使TAK1(即TGF-β活化的激酶)活化，从而通过IκB激酶级联反应，最后导致转录因子AP-1(activating protein-1)家族的成员Jun和fos活化。而NF-кB和AP-1的活化均可导致炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6和NO等的大量表达，介导炎症反应。其信号转导可以介导B7家族成员表达活化，进而通过抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)使 T细胞增殖及分化。这条途径即MyD88依赖信号传导途径。此外，LPS/TLR4信号的传导还可以通过另外一条通路MyD88非依赖信号传导途径(TRIF依赖途径):TRIF(TIR domaincontainingadaptor molecule-1，TICAM-1)全称为TLR样受体相关的干扰素活化子，也称含有TIR的接头分子。TRIF相关的接头分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)在TLR4的信号传递途径中起到辅助TRIF传导信号的作用。激活核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)从而激活 IкB激酶(IKK)。干扰素调节因子 3(interferon regulation factor 3，IRF3)是转录因子，是TRIF依赖途径的最终效应分子，可引起细胞内的终活化子NF-κB分子的激活，引发机体一系列的反应［7-9］。在此信号通路中，如果TLR发生变异，则信号传导受阻，机体不能产生免疫应答。

2 T细胞的活化决定器官移植排斥的发生

遗传基因不同的个体之间的器官移植，由于供、受体移植抗原的不同，既可引起宿主的排斥反应，又可引起供体来源的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)。在这个过程中，异种T细胞活化是移植反应中的关键环节，它的活化需要2个信号，第一信号是抗原递呈细胞向T淋巴细胞递呈处理过的抗原肽复合物，第二信号是来自APC的CD80、CD86和CD40等共刺激分子的共刺激信号［10］。近来研究认为，在T细胞反应的早期，当T细胞识别APCs递呈的抗原时，APCs是否能够表达足够的CD86、CD80和CD40等共刺激分子决定了T细胞是否产生免疫应答，或是未被活化导致凋亡或无能［11-12］。T淋巴细胞只有在第一、第二信号共同刺激下才能被激活和发生增殖，从而启动由淋巴细胞、细胞因子和补体等多因素参与的移植免疫排斥反应。

目前，移植免疫的研究主要集中在T细胞和B细胞等特异性免疫领域，虽然取得了显著的成就，但仍未能完全解决移植中的一些关键问题。根据文献报道［13］和我们的临床经验［14］，在HLA位点相合的造血干细胞移植中，II-IV急性GVHD发病率高达30%以上，而且随HLA不合程度增加，GVHD发病率及严重程度明显增高。即使早期应用霉酚酸酯(mycophenolatemofetil，MMF)、环 孢 素 A(eyclosporine A，CsA)等多种免疫抑制剂，仍有很多移植术后的患者发生难以控制的GVHD［15］。Rachel［16］等对 23 个以上的临床研究进行总结，发现器官移植后受者体内新生的抗HLA抗体与急性和慢性排斥的增加有关联，其可降低肾脏、心脏、肺、肝和角膜移植后移植物的存活率。而HLAⅠ和Ⅱ型抗体似乎均为损害移植物的抗体，大多数研究均提示供体的特异性抗体与移植物排斥有关。检测移植后体内HLA抗体可以预测患者异基因排斥的发生情况，帮助鉴别移植物的无能是免疫性还是非免疫性因素所致。

异基因造血干细胞移植后宿主发生GVHD，主要是移植物中的成熟T细胞被宿主的异型组织相容性抗原(包括主要与次要相容性抗原)所激活，增殖分化为效应T细胞。这些激活的效应细胞对宿主的组织和器官发动免疫攻击，从而导致GVHD的发生［11］。所以，为了降低宿主GVHD的严重程度，移植前需要对供受者的主要组织相容性抗原进行配型，从而增加移植的成功率。此外，寻找影响移植后GVHD发生的其他因素也成为了关注的重点。

3 TLR4在器官移植排斥中的重要作用

人TLR4基因有Asp299Gly和Thy399Ile两个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位点，其与TLR介导的免疫反应减弱有关［17］。在TLR4突变体移植受者中，接受肺移植后发生急性排斥反应的概率小，发病率为44%，而正常TLR4基因表型的移植受者发病率为 71%［18］。在肾移植中［19］，TLR4 突变体受者的急性移植排斥发病率为7.4%，野生型受者发病率为26.1%，明显高于前者。此外，有学者证实发生Asp299Gly变异的个体，易受到革兰氏阴性细胞感染的威胁［18］。也有研究者发现，TLR4突变的肾移植受者，其发生急性排斥的风险要比TLR4正常人群小，而且不易发展为动脉粥样硬化［19］。在对心脏移植术后患者进行研究后显示，TLR4表达水平高的受者心脏发生慢性排斥反应的风险要明显小于TLR4低表达患者，这说明TLR4参与了心脏移植过程的调控。在MHC不匹配的小鼠间进行同种异型心脏移植研究发现，除了TLR3以外，所有TLRs信号途径都以MyD88作为共同的信号连接蛋白。MyD88缺陷小鼠尽管活化T细胞的功能受损，而发生慢性移植排斥反应的受者其单核细胞TLR4的表达上调，IL-12和TNF-α的分泌增加，依然可以引发移植排斥反应，说明抗原特异性的免疫反应仍然是决定排斥或耐受的关键，也说明免疫调节是一个很复杂的过程［20-21］。

TLR4参与移植排斥的可能机制是:抗原递呈细胞表面的 TLR4与配体结合后，通过MyD88依赖性或非依赖信号途径激活NF-κB，诱导机体释放相关免疫因子，促进了树突状细胞、单核细胞等APC成熟，并上调MHC-Ⅱ及CD80、CD86等共刺激分子的表达，提供了T细胞活化必须的第二信号，APC移行至淋巴结，并通过抗原组织相容性复合物(MHC)的递呈作用刺激特异性T细胞，激活初始型T细胞，使其增殖分化为效应细胞，产生炎症细胞因子，引发一系列反应，最后对宿主组织或移植物产生破坏［22］。进一步研究发现，TLR激活的APCs分泌能诱导TH1分化的重要细胞因子IL-12，促进CD4+T细胞向TH1或TH2型细胞分化，不同的异种抗原通过结合不同的TLRs，引发不同的免疫反应，而效应性T细胞向不同的方向分化决定了免疫反应的差异。如低剂量LPS易诱发Th2免疫反应，而高剂量LPS则诱发Th1免疫反应。大多数的学者认为，TLR信号主要引起Th1免疫反应［23］。TH1型细胞主要分泌细胞因子IFN-γ、IL-2等，并主要参与细胞免疫，增加移植物的排斥;TH2型细胞主要分泌细胞因子IL-4、IL-10。一般认为T细胞Thl亚群向Th2亚群漂移，可以改变移植物局部的免疫反应，抑制细胞介导的排斥反应［24］。由此可见，TLRs在诱导获得性免疫和对移植物排斥反应的过程中起着重要桥梁作用。

Goldstein［25］等在小鼠皮肤移植模型实验中发现，TLR依赖的信号传导途径能够诱导DC细胞成熟，诱导CD8+T细胞的活化，从而激发异基因免疫反应。这表明天然免疫系统在异基因移植抗原识别中也起着重要作用。由此可见，TLRs不仅在机体固有免疫应答中发挥重要作用，同时也是连接固有免疫与适应性免疫的桥梁。

为了防治GVHD和移植排斥，临床使用多种免疫抑制剂，大多主要作用于T淋巴细胞，取得了较好的疗效，但同时也提高了感染和移植后肿瘤复发的风险。虽然供受者之间的HLA位点不相合是GVHD的重要危险因素，但是细菌感染也是GVHD的主要病因之一［26］。革兰氏阴性菌及其内毒素成分LPS，在小鼠骨髓移植模型中已经被发现与GVHD发生有关［27］。接受LPS耐受供者骨髓的小鼠GVHD严重情况明显低于接受LPS敏感供者的小鼠。当细菌通过肠黏膜后，在供者T细胞分泌的炎性因子的作用下，LPS激活巨噬细胞分泌TNF-α等效应分子。而且在小鼠移植模型中，内毒素血症和巨噬细胞活化与GVHD的发病机制密切相关。Elmaagacli［28］等发现，在造血干细胞移植中，TLR4基因的突变与严重GVHD的发病率相关。TLR4基因的突变可以调控造血干细胞移植患者的免疫反应能力。Lorenz［29］等通过对237名造血干细胞移植患者的TLR基因多态性分析后认为，TLR4基因的突变可以减少急性GVHD的发生，但是这种突变增加了革兰氏阴性菌感染的几率。以上众多研究表明，TLR4在非特异性免疫中可广泛识别配体，既可针对入侵的病原体，也可识别改变的自身成分，充分显示了TLR4在识别危险信号并诱发机体免疫反应中的重要性。

Nomura［30］等还发现，TLR4 表达的变化会影响机体对内毒素的耐受性。用不同剂量LPS二次重复刺激小鼠腹腔巨噬细胞，发现炎症因子的分泌与LPS的剂量和LPS处理后的时间呈依赖性减少;再者，TLR4的表达在1 h内开始呈持续性梯度下降，并保持24 h，而炎症因子的分泌与TLR4下调呈正相关，这可能是内毒素耐受程度与TLR4的下调程度呈正相关的机制。Manicassamy［31］等发现，MyD88 是介导TLR4信号转导通路中的重要环节，而MyD88功能缺失则导致TLR信号的表达缺陷。MyD88缺陷引起移植物排斥减弱的机制是DC成熟受阻，从而导致T细胞增殖的障碍及Th1免疫反应减弱，但同时检测IL-4、同种IgG1时却发现并未影响到Th2免疫反应［32-33］。由上可见，TLR4依赖的内毒素信号传导通路中的某些环节发生改变将不同程度的产生对LPS的耐受性。这一特点将对我们在控制急性GVHD中细胞因子“瀑布样效应”起到一定的启示作用。

4 展望

TLR4信号传导途径与机体器官移植后的免疫排斥反应有密不可分的联系。研究TLR4信号途径如何通过调控APC成熟、活化T细胞、引发免疫攻击等具体机制以及探讨TLR4对诱导移植免疫耐受的重要影响等，将帮助我们在以后的临床治疗中针对个体制定策略，预防和治疗同种器官移植后患者免疫排斥反应。同时也可能为将来针对TLR4相关免疫抑制靶点研发出高效免疫抑制药物，为减轻移植排斥提供新的治疗手段。

［1］KAWAI T，AKIRA S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors［J］.Nat Immunol，2010，11(5):373-384.

［2］MEDZHITOV R， PRESTON-HURLBURT P，JANEWAY CA.A human homologueofthe drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity［J］.Nature，1997，388:394-397.

［3］ABREU M T.Toll-like receptor signaling in the intestinalepithelium:how bacterialrecognition shapes intestinal function ［J］.Nat Rev Immunol，2010，10(2):131-144.

［4］KUMAR H，KAWAIT，AKIRA S.Toll-like receptors and innate immunity［J］.Biochemical and BiophysicalResearch Communications，2009，388:621-625.

［5］WANG P L，OHURA K.Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide signaling in gingival fibroblasts-CD14 and Toll-like receptors ［J］.Critical Reviews in Oral Biology ＆ Medicine，2002，13:132-142.

［6］TSAN M F，GAO B.Heat shock proteins and immune system ［J］.JournalofLeukocyte Biology，2009，85:905-910.

［7］LI M，ZHOU Y，FENG G，et al.The critical role of Toll-like receptor signaling pathways in the induction and progression of autoimmune diseases［J］.Current Molecular Medicine，2009，9:365-374.

［8］LU Y C，YEH W C，OHASHI P S.LPS/TLR4 signal transduction pathway［J］.Cytokine，2008，42:145-151.

［9］KAISHO T，AKIRA S.Toll-like receptor function and signaling ［J］.JournalofAllergy and Clinical Immunology，2006，117:979-987.

［10］APPLEMAN L J，BOUSSIOTIS V A.T cell anergy and costimulation ［J］.Immunological Reviews，2003，192:161-180.

［11］PACZESNY S，HANAUER D，SUN Y，Reddy P.New perspectives on the biology of acute GVHD［J］.Bone Marrow Transplant，2010，45:1-11.

［12］GONZALEZ B，GUERRA C，MORRIS D.Dendritic cells in infectious disease，hypersensitivity，and autoimmunity ［J］.InternationalJournalof Interferon，Cytokine and Mediator Research，2010，2:137-147.

［13］WOJNAR J，GIEBEL S，KRAWCZYK-KULIS M，et al.Acute graft-versus-host disease.The incidence and risk factors［J］.Ann Transplant，2006，11(1):16-23.

［14］MENG Xiao-jian，LIN Mao-fang，CAI Zhen(盂筱坚，林茂芳，蔡 真).Relationship between the IFN-gamma producing cells specific for recipient and acute graft versus host disease［J］.Chinese Journal Hematology(中华血液学杂志)，2006，27:95-98.(in Chinese)

［15］HUANG He ，CAI Zhen，LIN Mao-fang，et al(黄河，蔡 真，林茂芳，等).Treatment of childhood leukemia with unrelated donor allogeneic bone marrow transplantation［J］.Chin J Pediatr(中华儿科杂志)，2004，42:835-839.(in Chinese)

［16］MCKENNA R M，TAKEMOTO S K，TERASAKI P I.Anti-HLA antibodies after solid organ transplantation1 ［J］.Transplantation，2000，69:319-326.

［17］SMIMOVA I，HAMBLIN MT，McBRIDE C，et al.Excess of rare amino acid polymorphisms in the Toll-like receptor 4 in humans ［J］.Genetics，2001，158:1657-1664.

［18］PALMER S M，BURCH L H，Davis R D，et al.The role of innate immunity in acute allograft rejection after lung transplantation ［J］.American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，2003，168:628-632.

［19］DD M D，MY C F，JB P S，et al.Relevance of Tolllike receptor-4 polymorphisms in renal transplantation ［J］.Kidney International，2005，67:2454-2461.

［20］METHE H，ZIMMER E，GRIMM C，et al.Evidence for a role of toll-like receptor 4 in development of chronic allograft rejection after cardiac transplantation ［J］.Transplantation，2004，78:1324-1331.

［21］TESAR B M，ZHANG J，LI Q，et al.TH1 Immune responses to fully MHC mismatched allografts are diminished in the absence of MyD88，a Toll-like receptor signal adaptor protein ［J］.American Journal of Transplantation，2004，4:1429-1439.

［22］REIS E-Sousa C.Toll-like receptors and dendritic cells:forwhom thebugtolls ［J］.Semin Immunol，2004，16(1):27-34.

［23］DABBAGH K，LEWIS D B.Toll-like receptors and T-helper-1/T-helper-2 responses ［J］.Current Opinion in Infectious Diseases，2003，16:199-204.

［24］NIKOLIC B，LEE S，BRONSON R T，et al.Th1 and Th2 mediate acute graft-versus-host disease，each with distinct end-organ targets［J］.Journal of Clinical Investigation，2000，105:1289-1298.

［25］GOLDSTIN D R.Toll-like receptors and other links between innate and acquired alloimmunity［J］.Current Opinion in Immunology，2004，16:538-544.

［26］MULLIGHAN C G，BARDY P G.New directions in the genomics of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation ［J］.Biology ofBlood and Marrow Transplantation，2007，13:127-144.

［27］ABDUL-HAI A，WEISS L，SLAVIN S，Or R.Improved survival following induction of GVHD following lipopolysaccharide immunization ［J］.Experimental Hematology，2006，34:549-553.

［28］ELMAAGACLI A H，KOLDEHOFF M，HINDAHL H，et al.Mutations in innate immune system NOD2/CARD 15 and TLR-4(Thr399Ile)genes influence the risk for severe acute graft-versus-host disease in patients who underwent an allogeneic transplantation ［J］.Transplantation，2006，81:247-254.

［29］LORENAZ E，SCHWARTZ D A，MARTIN P J，et al.Association of TLR4 mutations and the risk for acute GVHD after HLA-matched-sibling hematopoieticstem celltransplantation ［J］.Biology ofBloodandMarrow Transplantation，2001，7:384-387.

［30］NOMURA F，AKASHI S，SAKAO Y，et al.Cutting edge:endotoxin tolerance in mouse peritoneal macrophages correlates with down-regulation of surface toll-like receptor 4 expression ［J］.The Journal of Immunology，2000，164:3476-3479.

［31］MANICASSAMY S，PULENDRAN B.Modulation of adaptive immunity with Toll-like receptors［J］.Semin Immunol，2009，21(4):185-193.

［32］IWASAKIA，MEDZHITOV R.Regulationof adaptive immunity by the innate immune system［J］.Science，2010，327(5963):291-295.

［33］YAA M N，PAOLO P，PETER S，et al.Toll-like receptor 4 polymorphismsand risk ofgramnegative bacteremia after allogeneic stem cell transplantation.A prospective pilot study ［J］.Biology ofBloodandMarrow Transplantation，2009，15:1130-1133.