雷帕霉素协同去甲氧柔红霉素诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株凋亡的作用

赵妍敏，吴康妮，王颖佳，吴功强，曹伟杰，于晓红，黄 河

(浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，Akt/mTOR)信号通路调节异常与白血病等多种肿瘤形成、细胞恶性转化相关。Akt/mTOR在大部分急性髓系白血病细胞中存在组成性活化，mTOR上游蛋白Akt和下游蛋白4E-BP1、S6K均处于持续磷酸化状态。在慢性粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病细胞中也证实了mTOR信号通路的过度激活。mTOR信号转导通路的异常激活不仅参与白血病细胞的增殖、存活、代谢、细胞周期调控和葡萄糖转运等过程，而且可能与白血病对化疗药物的耐药相关。

急性T淋巴细胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)是一种恶性程度高、预后差的淋巴系统恶性克隆性疾病。近年来随着大剂量联合化疗方案的应用，T-ALL的预后有了较大改善，但仍有部分T-ALL患者对标准治疗耐药，出现难治或复发。蒽环类药物是治疗T-ALL诱导缓解方案的常用药物，对蒽环类药物信号通路的研究发现，其在引起细胞凋亡的同时，可激活Akt/mTOR和Raf/MEK/ERK等的信号通路，因而容易产生耐药［1-4］。

联合新型分子靶向治疗能克服化疗耐药、提高疗效，是近年来研究的热点。我们前期研究表明，mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin，Rapa)在T-ALL细胞中能有效地抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，并呈时间、浓度依赖地抑制细胞生长［5］。基于这些理论，我们拟研究雷帕霉素联用蒽环类代表药物去甲氧柔红霉素(idarubicin，IDA)治疗T-ALL的可能性，是否有助于克服T-ALL的耐药及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat由中科院上海细胞所引进。

1.2 主要试剂 雷帕霉素购于Sigma公司，以DMSO溶解，配成浓度为1 mmol/L贮存液，分装后-20℃贮存。IDA由辉瑞公司惠赠，以PBS溶解，配成浓度为5 μmol/L的贮存液，分装后-20℃贮存。贮存液于临用前再稀释至合适浓度，本实验DMSO终浓度不超过0.5%。CCK-8购于日本Dojindo公司。Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购于美国BD-Pharmingin公司。Caspase3、Caspase9、Caspase8、PARP、Akt、p-Akt、P70S6K、p-P70S6K、ERK 和 p-ERK 抗体购于美国Cell Signaling Technology公司;Actin和GAPDH抗体购于Santa Cruz公司;辣根标记山羊抗兔、山羊抗鼠IgG(H+L)购于北京中山生物技术公司。

1.3 细胞培养 Jurkat细胞采用含10%FBS的RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，2～3 d换液传代1次。取对数生长期细胞为实验对象。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖 选择对数生长期Jurkat细胞，接种于96孔板，各孔总体积200 μl，含有4×104个细胞，分别加入不同终浓度(0、1、2.5、5、10、25 和 50 nmol/L)的 IDA 或不同终浓度的IDA联合10 nmol/L雷帕霉素，培养24 h，同时设定对照组，每组设4个复孔。到达时点后，加入CCK-8 10 μl/孔，继续培养4 h，于酶标仪450/630 nmol/L双波长测定吸光度A值。按以下公式计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%，并计算半数抑制浓度(50%inhibition concentration，IC50)剂量。

1.5 Isobologram法分析两药联合作用的性质

将单用雷帕霉素或IDA的IC50为横纵坐标末端点，以直线相连;将联用雷帕霉素和IDA使细胞生长抑制率为50%的不同剂量为横纵坐标描点。若联合用药点在直线之下表示联合指数(combination index，CI)小于1，两药联合有协同作用;在直线上表示联合指数等于1，两药联合有相加作用;在直线之上表明联合指数大于1，两药联合有拮抗作用［6］。

1.6 透射电镜形态学观察 收集细胞，以PBS洗涤2次，1 000 r/min离心，沿管壁逐滴加入3%戊二醛固定，包埋切片后，定位观察并照相。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 参照Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。细胞以5×105/ml接种于6孔培养板，并以单药及联合用药处理细胞。选取单药24 h生长抑制率小于20%的浓度，因此选取IDA 5 nmol/L、雷帕霉素10 nmol/L浓度处理细胞。同时，设DMSO对照组，24 h后收获细胞。收集1×106个细胞，冷 PBS洗涤2次，1 000 r/min离心，4℃ 7 min，弃上清。将细胞重悬于1 ml 1×Binding buffer，取 100 μl细胞置于流式细胞仪专用试管中，加 5 μl Annexin V FITC 和 5 μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，加入300 μl 1×Binding buffer，立即用流式细胞仪检测，Cellquest 1.2分析软件分析结果。

1.8 免疫印迹实验 药物处理剂量同上。即收集经IDA 5 nmol/L、雷帕霉素10 nmol/L、IDA 5 nmol/L联合雷帕霉素10 nmol/L处理24 h细胞及对照组细胞，提取总蛋白，采用Brad-ford法检测蛋白浓度。将50 g蛋白经10% ～12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，转移至PVDF膜，于摇床上封闭2 h，然后分别加入单克隆抗 Caspase3、PARP、Caspase8、Caspase9、Akt、pAkt、P85S6K、p-P85S6K 、P70S6K、p-P70S6K、ERK、p-ERK 一抗，4 C过夜，TBS/T充分漂洗。加入辣根过氧化物酶连接的二抗，室温孵育1.5 h，同上漂洗，与ECL化学发光试剂反应1 min，常规方法显影、定影。以Quality One软件计算蛋白产物条带的相对光密度值。

1.9 统计分析方法 采用SPSS 12统计处理软件分析，计量资料实验数据以均数±标准差(±s)表示。多组资料均数之间的比较采用One way ANOVA，两两比较采用 SNK-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷帕霉素联合IDA对Jurkat细胞株的增殖抑制作用 CCK8法检测发现IDA作用Jurkat细胞24 h的IC50为21.8 nmol/L，雷帕霉素作用Jurkat细胞24 h的IC50为344 nmol/L，联合10 nmol/L的雷帕霉素能使IDA的IC50降至 2.95 nmol/L。单用 1 nmol/L、2.5 nmol/L、5 nmol/L的IDA作用Jurkat细胞24 h的增殖抑制率分别为(4.06±4.3)%、(4.25±1.48)%、(19.72±13.06)%，而与10 nmol/L雷帕霉素联用后，增殖抑制率分别增加为(36.73±10.19)%、(38±11.08)%、(55.37±16.3)%(图1-A)。

按Isobologram方法［6］得出两药的联合指数小于1，说明两药对Jurkat细胞株的增殖抑制具有协同效应(图1-B)。

图1 IDA单用及联用雷帕霉素作用Jurkat细胞24 h的生长抑制作用Fig.1 Inhibition rate of Jurkat cell viability exposed to IDA or IDA+rapamycin for 24 hours

2.2 雷帕霉素增强IDA对Jurkat细胞株的诱导凋亡作用

2.2.1 形态学观察 光镜下观察未经处理的Jurkat细胞呈现圆形或椭圆形，大小均一，部分成团生长，折光度强;经低浓度IDA处理的细胞形态上无明显差异，少部分出现体积减小;经10 nmol/L雷帕霉素联合低浓度IDA处理24 h的细胞出现明显的空泡化、体积缩小变形，折光度降低，并有较多的细胞碎片。采用电镜进一步观察，发现未经处理和单用低浓度IDA处理的细胞体积均较大，核仁明显，染色质疏松;经IDA和雷帕霉素联用处理后体积变小，胞核固缩不规则，染色质浓缩边集，胞核成半月形(图2)。

图2 IDA单用及联用雷帕霉素作用Jurkat细胞24 h的电镜观察Fig.2 Morphological changes of Jurkat cells exposed to IDA or IDA+rapamycin for 24 hours under electron microscope

2.2.2 PS转位分析 Annexin VFITC和PI双标记细胞后经流式细胞仪检测结果显示，10 nmol/L雷帕霉素、5 nmol/L IDA及5 nmol/L IDA+10 nmol/L雷帕霉素作用于Jurkat细胞24 h，凋亡细胞百分数分别为(7.21±2.63)%、(17.51±3.20)%、(50.17±5.19)%，与空白对照组(6.78±2.17)%相比，IDA组及IDA+雷帕霉素组的凋亡细胞百分数均有升高(P＜0.01)，而IDA+雷帕霉素组较IDA组的凋亡细胞百分数显著升高(P＜0.01，图3)。说明雷帕霉素单药虽不能引起Jurkat细胞发生明显的凋亡，但可增强IDA诱导凋亡的作用。

图3 IDA单用及联用雷帕霉素作用Jurkat细胞24 h的凋亡比例Fig.3 Apoptosis in Jurkat cells after treatment of IDA and/or rapamycin for 24 hours using Annexin V/PI staining method

2.3 Caspase3、8、9及 PARP活性的分析 分别以 10 nmol/L雷帕霉素、5 nmol/L IDA、5 nmol/L IDA+10 nmol/L雷帕霉素处理Jurkat细胞24 h，经Western blot检测可见IDA单用组Caspase3、Caspase9、PARP激活带不明显，Caspase8激活带较弱，而联用组出现明显的Caspase3、8、9 和 PARP 激活带(图4)。

2.4 雷帕霉素联合IDA对Jurkat细胞株的Akt/mTOR、ERK信号通路的影响 本实验在Jurkat细胞株中检测了IDA对Akt/mTOR、ERK信号通路的活化状态的影响。结果发现5 nmol/L IDA明显促进Jurkat细胞S6K的磷酸化，且增强Akt的磷酸化，明确了IDA对Akt/mTOR信号通路活化的作用，而联用10nmol/L雷帕霉素能使Jurkat细胞株P70S6K和Akt磷酸化水平明显降低。此外，单用5nmol/L IDA或10nmol/L雷帕霉素对ERK的磷酸化均无明显影响，但两药一旦联用，则能协同下调ERK的磷酸化水平(图5、表1)。说明两药联用能通过抑制Akt/mTOR、ERK信号通路而发挥抗T-ALL作用。

表1 IDA单用及联用雷帕霉素处理Jurkat细胞24 h磷酸化Akt、ERK1/2蛋白的半定量表达Table 1 Semi-quantitation of phosphorylation levels of Akt and ERK1/2 in Jurkat cells after treatment of IDA and/or rapamycin for 24 hours

3 讨论

近年来研究发现，雷帕霉素可与传统化疗药物存在着协同作用。在多发性骨髓瘤中，雷帕霉素能够协同地塞米松引起细胞凋亡［7-8］;NPM-ALK阳性的间变性大细胞淋巴瘤易产生地塞米松的耐药，而雷帕霉素能克服其耐药并增强了地塞米松诱导凋亡的作用［9］;在B-ALL的非肥胖性糖尿病/重度联合免疫缺(NOD/SCID)小鼠模型中，雷帕霉素的衍生物RAD001与长春新碱联用，可明显延长小鼠的生存时间［10］。

本研究经CCK-8实验证实，低浓度的雷帕霉素能显著增强IDA对Jurkat细胞的增殖抑制作用。IDA与雷帕霉素两者联用时能明显抑制细胞的增殖，联合指数小于1。但这种协同作用主要发生在IDA浓度较低时，当IDA剂量超过半数抑制浓度后，两者联合用药几乎没有作用，这提示低浓度雷帕霉素与小剂量IDA联用，有助于提高疗效，减低IDA的毒副反应。

本研究利用AV/PI染色流式细胞仪检测发现，虽然单用雷帕霉素不能引起Jurkat细胞明显凋亡，但能显著增强IDA的诱导凋亡作用;电镜形态学观察也证实了雷帕霉素对IDA诱导凋亡的增强作用。

细胞凋亡是多细胞生物体内的一个重要生命现象，胱天蛋白酶Caspases被认为是凋亡的中心实施者。依据凋亡信号起源的不同，细胞凋亡的Caspase通路分为细胞外(死亡受体)和细胞内(线粒体)通路。细胞色素C的释放可以启动Caspase的细胞内通路(线粒体途径)。细胞色素C一旦释放即与细胞凋亡蛋白酶活化因子-l(Apaf-1)结合，活化Caspase9，继而激活下游 Caspase3和 Caspase7，诱导细胞凋亡［11］。Caspase的细胞外通路(细胞膜途径)是由Fas/FasL信号或TNF/TNFR-1信号启动，通过胞质中Fas相关死亡域(FADD)与Caspase8结合，使Caspase8自身裂解而活化，然后激活下游的Caspase3导致细胞凋亡。

在本实验中，IDA联用雷帕霉素较IDA单用更显著地激活了Caspase3和底物聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶PARP(poly ADP-ribosepolymerase)，再一次证实了雷帕霉素对IDA引起凋亡的增敏作用。而Caspase8和Caspase9在两药联用组都呈现出最明显的激活，这说明两药联用后是通过细胞膜和线粒体双途径影响细胞凋亡的。

既往研究认为，蒽环类药物在某些实体肿瘤中可激活Akt/mTOR和MAPK/ERK信号通路而产生耐药性。与Akt/mTOR信号类似，MAPK/ERK信号的异常激活也常与白血病细胞的增殖和耐药相关［1-4］。本实验在Jurkat细胞株中检测了IDA对Akt/mTOR和ERK信号通路的活化状态的影响，结果发现IDA能促进Akt和S6K蛋白的磷酸化，明确了IDA对Akt/mTOR信号通路活化的作用，而联用雷帕霉素能使P70S6K和Akt酸化水平明显降低。此外，单用小剂量的IDA和雷帕霉素对ERK的磷酸化均无明显影响，但两药一旦联用，则能协同下调ERK的磷酸化水平。这说明两药联用能通过抑制Akt/mTOR、ERK信号通路而发挥抗T-ALL作用。

本研究证实，雷帕霉素和IDA对 T-ALL Jurkat细胞的生长抑制具有协同作用。两药联用时能通过线粒体和细胞膜双途径增强凋亡效应。此外，雷帕霉素能逆转IDA引起的Akt/mTOR信号通路的激活，并协同抑制ERK信号的活化，为临床上两药的联用提供了体外实验证据。

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