异基因造血干细胞移植中GVHD与GVL分离策略

黄 河，刘丽珍

(浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心，浙江杭州310003)

异基因造血干细胞移植(allo-hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是目前治愈血液系统恶性肿瘤的有效手段之一，近年来随着allo-HSCT技术的的发展，移植成功率与长期生存率都有了很大的提高，但移植物抗宿主病(GVHD)和移植后肿瘤复发是影响患者存活率的主要障碍［1］。移植物抗白血病效应(GVL)是allo-HSCT治愈血液系统恶性肿瘤的主要机制。GVHD与GVL效应的机制目前尚未完全明确，但两者均为由供者T细胞介导的免疫反应。如供者T细胞广泛性地作用于受者组织细胞，则发生GVHD;如供者T细胞只针对异常细胞(白血病细胞或其他肿瘤细胞)则发挥GVL效应［2］。临床上GVHD与GVL常相伴发生，但两者并不完全平行。如何有效控制GVHD的同时充分发挥 GVL效应，提高allo-HSCT患者的生存率，是造血干细胞移植领域的热点与难点问题。

1 供者淋巴细胞输注

供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion，DLI)可以消除供者体内残留的白血病细胞，预防甚至逆转allo-HSCT后复发，是移植后增强GVL效应的重要治疗方法。而GVHD是DLI主要的并发症，适宜的输注时机、输注量与输注成分的调控是避免或减轻GVHD的关键［3］。临床上采取分次逐级增量DLI方法，与单次大剂量输注相比，其发挥GVL作用所需时间延长。一般输入细胞数从106/kg数量级开始，逐级增量至发挥GVL作用，多在DLI后3～7周起效，6个月以上达分子水平缓解。逐级增量DLI并不影响GVL的效应强度，但可明显减少GVHD的发生概率。改变输注成分，如调节淋巴细胞中Thl与Th2细胞亚群比例有利于GVHD与GVL的分离。有研究发现，移植后输注Th2细胞能诱导剂量依赖GVL效应，而不增加严重急性GVHD的发生。增加移植物中Th2细胞比例，减弱Thl细胞分泌IFN-γ等细胞因子，可以减少GVHD的发生，同时保留Th2细胞抗原呈递功能及调节细胞毒性T细胞(CTL)的能力，发挥 GVL 作用［4］。

输入淋巴细胞的调控可以通过转入“自杀基因”来实现。通过转基因技术给输注的供者T细胞预先转入一段“自杀基因”片段，如单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-TK)，转染的T细胞可被更昔洛韦特异性杀伤，当发生GVHD时应用更昔洛韦清除带HSV-TK基因的T细胞，可缓解疾病的临床症状。一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验，在28例接受HLA半相合移植的患者中，不使用GVHD预防药物，于移植后第28天开始输注供者带HSV-TK基因的T细胞，结果仅10例患者发生急性GVHD，这些患者经使用更昔洛韦治疗后均获得缓解。研究者认为，带HSVTK基因的T细胞输注在半相合移植中可促进免疫重建，控制 GVHD的发生［5］。

2 调节性T细胞

CD4+CD25+调节性 T细胞(regulatory Tcells，Treg)是CD4+T细胞的一个亚群，在维持机体自身免疫耐受，诱导移植耐受等方面发挥重要作用。Treg细胞分为天然性和诱导性两大类:前者在胸腺中经历阴性选择发育成熟，在外周通过细胞间接触或分泌细胞因子的方式控制自身免疫反应的发生;后者由外周CD4+T细胞受抗原刺激活化产生，主要通过分泌抑制性细胞因子控制免疫应答［6］。Treg细胞可能通过以下机制抑制T细胞的活化增殖，进行免疫负调控:①抑制抗原递呈细胞(APC)的抗原呈递功能;②与靶细胞直接接触抑制;③分泌抑制性细胞因子，如TGF-β、IL-10等;④竞争性抑制靶细胞增殖。Treg免疫标志包括表型为CD4+CD25+Foxp3+，同时表达 CTLA-4与 CD45R等。

动物实验与临床试验显示:Treg细胞可降低GVHD的发生，而不影响 GVL的效应，在allo-HSCT中有一定的应用前景。Edinger等［7］在MHC完全不相合的小鼠移植模型研究中发现，按1∶1回输供者Treg细胞和供者同种T细胞，Treg可抑制供者效应性T细胞的早期扩增和迁移至靶器官的数量，有效地降低GVHD的发生率和严重度，但不影响T细胞的活化，而且对T细胞体内外GVL效应都无显著影响。Trenado等［8］也发现，Treg细胞主要抑制 GVHD相关的效应T细胞增殖，但并不影响造血和免疫重建，并可部分保留 GVL效应。最近，Dilanni等［9］报道了28例高危血液恶性肿瘤患者行半相合HSCT后，过继性输注Treg，未给予任何免疫抑制剂即可有效地预防GVHD的发生，促进免疫重建，而且未削弱GVL的效应。

天然性Treg细胞只占外周总T细胞的5%～10%，如何获得足够数量的Treg成为过继性输注的一大障碍。最近，Hippen［10］等报道了采用雷帕霉素/TGF-β体外大量诱导并扩增Treg细胞的方法，发现体外培养扩增的Treg细胞在异基因移植小鼠中发挥抑制GVHD的作用。此研究为临床大规模Treg细胞的应用提供了方法。另外，近年研究发现，一些药物如地西他滨、阿扎胞苷、雷帕霉素等可以诱导Fox P3的表达，提高了受者体内Treg细胞的比例［11］，从而预防 GVHD的发生，实现与 GVL效应的分离。

3 NK细胞

自然杀伤细胞(natural killer cells，NK细胞)是淋巴细胞谱系中不同于T、B淋巴细胞的一类大颗粒淋巴细胞，其代表性表型为CD3-CD56+CD16+。NK细胞具有直接杀伤靶细胞的效应，无需预先致敏。NK细胞功能的发挥主要依赖于其识别靶细胞的受体。NK细胞可同时表达活化型受体(KAR)和抑制受体(KIR)，其杀伤功能取决于表面抑制性受体与活化受体所传递信号的综合。正常情况下，NK细胞KIR识别自身组织表达的MHC-I类分子，产生杀伤抑制信号，阻断杀伤信号的传递，表现为自身组织细胞不被破坏。当靶细胞表面MHC-I类分子表达降低、丢失或发生变异(如细胞发生恶性转化、病毒感染等)时，NK细胞活化并启动杀伤作用，此即NK细胞的丢失自我(missing self)识别模式［12］。

NK细胞是参与GVL效应的重要成员。一系列临床研究显示:在去T的allo-HSCT中，尤其对于CML及AML、HLA-C/KIR不合的患者复发率较低［13］。我们的前期研究也发现在无关供者移植患者中，KIR不相合与低复发风险相关。在髓系患者，KIR不合除了与复发的风险减少相关外，还能改善5年生存率［14］。NK细胞在GVL中的作用在动物实验中已得到证实。目前认为，NK细胞发挥GVL效应的机制是通过“丢失自我”模式实现的。移植后供者的NK细胞KIR受体找不到相应的MHC配体，NK细胞活化占优势，对残存的白血病细胞发挥杀伤作用。KIR表位不合是引发GVL的分子基础，可以作为供者选择的考虑因素。

抗原递呈细胞(APC)活化后表达共刺激分子并向T细胞呈递抗原，进而活化T细胞是GVHD发生的关键环节。研究发现，异源反应性NK细胞可以攻击和去除宿主APC，从而阻止GVHD的发生。虽然杀伤受者APC对GVL效应有影响，但异源反应活性NK细胞对肿瘤细胞有强大的杀伤功能，故 GVL效应被保留［15］。NK细胞在分离GVHD与GVL效应中有一定的前景。本研究组发现［16］，经体外培养的人NK细胞能杀伤不成熟的DC细胞。NK细胞对成熟的DC杀伤活性较低，但以抗体封闭KIR抑制性受体KIR2DL1和(或)KIR2DL2/KIR2DL3后，NK细胞对成熟DC的杀伤活性明显提高。此研究还发现，封闭人NK细胞抑制性受体后，NK细胞杀伤肿瘤细胞的作用增强。本研究组对小鼠NK细胞抑制性受体的封闭实验也得出了相似的结论［17］。NK细胞表面KIR修饰为GVL与GVHD效应的分离提供了新思路。

4 树突状细胞

树突状细胞(dendritic cells，DC)是功能最强的抗原递呈细胞，在移植免疫中，DC启动免疫排斥还是维持免疫耐受取决于它们的起源以及成熟状态，成熟DC启动免疫排斥及GVHD反应，未成熟(iDC)及淋巴样DC诱导免疫耐受。HSCT后供者DC细胞和受体残存的DC都可直接激活供体T细胞，特别是CD8+T细胞的增殖和分化，引起GVHD。因此，通过清除或灭活受体DC，调控供体DC的分化以及活化状态可以预防GVHD，诱导免疫耐受［18］。近年来研究者发现，iDC在TGF-β1等诱导下可产生调节性DC或称为耐受型DC，这群DC细胞高表达TGF-β1和 IL-10;同时，其可以减少前炎症细胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 IL-12p70等的分泌，有利于抑制GVHD的发生［19］。

供者DC通过交叉启动同种异基因反应性CD8+T细胞介导GVL，骨髓移植后用肿瘤细胞裂解物免疫的供者DC作为疫苗［20］，可以促进T细胞的GVL效应。盛丽霞等［21］将多药耐药基因MDR1转染DC前体细胞K562，并采用细胞因子诱导法将K562/MDR1诱导为携带有MDR1基因的 DC细胞。由于MDR1编码的Pgp蛋白具有免疫原性，MDR-DC可诱导参与针对Pgp的特异性CTL应答。此研究为白血病多药耐药的免疫治疗与allo-HSCT后过继性输注增强GVL效应提供了新靶点。

5 间充质干细胞

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的一类干细胞，是骨髓基质细胞的前体细胞，具有自我更新和多向分化的生物学特性。MSCs具有独特的免疫学特性，它高表达MHC I类分子、CD44和CD90，低表达MHCⅡ类分子及Fas配体，不表达 B7-1、B7-2、CD40、CD40L 和 Fas凋亡受体。研究表明，MSCs具有低免疫源性并发挥免疫调控作用［22］。MSCs可通过细胞与细胞直接接触来抑制T淋巴细胞的增殖。动物实验已证实，MSCs对GVHD具有预防和治疗作用。多个临床研究中心已开展 MSCs用于预防和治疗GVHD的Ⅱ期临床研究。Fang等［23］对6例激素耐药的GVHD患者输注半相合供者或无关供体脂肪来源的MSCs，5例患者GVHD完全缓解，其中4例存活超过40个月。Baron等［24］对20例接受HLA不相合无关供者减剂量移植的患者，将第三方来源的MSCs与供者外周血造血干细胞共输注，结果表明MSCs共输注能降低GVHD相关死亡率，且并不减弱GVL效应。

6 次要组织相容性抗原

次要组织相容性抗原(minor histocompatibility antigens，mHags)是相对于主要组织相容性抗原而命名的，mHags由非MHC基因编码，在移植排斥反应中的作用较弱。在异基因造血干细胞移植中，供受体之间存在等位基因单核苷酸多态性(SNP)。某些SNP致使编码同源蛋白的氨基酸不同，蛋白经加工处理成多肽，与MHC结合表达于受者抗原递呈细胞表面，被供者T细胞作为外源物质所识别，这些多肽即mHags。mHags具有较强的免疫原性，局限表达于造血细胞起源细胞(如HA-1、HA-2)，或单一造血细胞系的mHags分子(如HB-1)，在体内可诱导产生特异性细胞毒性T细胞，对白血病或淋巴瘤细胞发挥细胞毒作用，对非造血细胞无细胞毒作用，从而增强GVL效应，不增加GVHD风险，实现 GVL效应与 GVHD的分离［25］。利用mHags的特性，临床应用包括:输注mHags特异性T细胞进行过继性免疫治疗，mHags特异性T细胞受体(TCR)基因转导以及mHags疫苗的开发［26］。

7 肿瘤疫苗

肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原可以作为肿瘤疫苗，刺激供者T细胞产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞，通过特异性的免疫应答杀伤白血病细胞，发挥GVL作用，而不引起GVHD。目前发现的肿瘤特异性抗原有 P21、ras、bcr/abl、PML/RARα;肿瘤相关性抗原有蛋白酶3和WT-1(wilms瘤基因)［27］。研究表明，白血病细胞高表达WT-1等非多态性肿瘤相关抗原。正常供者WT-1特异性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)比例很低，体外扩增的CTL可溶解人白血病细胞，抑制白血病克隆形成，抑制人白血病细胞植入NOD/SCID小鼠，对正常造血干细胞未见细胞毒作用。Bornhauser等［28］给14例患者预防性地输注由CML相关抗原肽段PR1、WT-1和ABL免疫产生的CTL，随访1年没有发现GVHD或疾病的复发。

另外，细胞因子如白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子等在GVHD发病及GVL的作用中也起到很重要的作用。国内外其他研究和我们的研究［29-30］都表明，细胞因子及细胞因子受体基因多态性同GVHD和/或移植预后显著相关。细胞因子基因多态性直接影响个体体内细胞因子的水平，而移植受者个体间的不同细胞因子水平将影响GVHD的发生与移植效果。动物研究表明，IL-11、IL-12、IL-18及角质细胞生长因子(KGF)能选择性地抑制T细胞介导的GVHD，同时保留GVL作用。细胞因子如IL-12、KGF等也可能作为GVHD与GVL的分离靶点。

总之，随着近年来对移植免疫机制研究的深入，GVHD与GVL的分离策略不断取得了新的进展，目前采取一系列临床手段进行干预且取得了一定效果，但更多的手段仍处在体外实验及在动物模型阶段。采取何种方法用于临床治疗能最大程度地减少GVHD的发生，同时加强GVL效应，仍需进一步的研究。

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