益生菌Lactobacillus helveticus 130B4在牛乳中的生长特性及其促长因子研究

李艳，栗永乐，李传娟，李秀丽，双全，宫本拓

（1．内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018；2．冈山大学大学院自然科学研究科，日本冈山700-8530）

益生菌Lactobacillus helveticus 130B4在牛乳中的生长特性及其促长因子研究

李艳1，栗永乐1，李传娟1，李秀丽1，双全1，宫本拓2

（1．内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018；2．冈山大学大学院自然科学研究科，日本冈山700-8530）

将具有ACE抑制活性的乳酸菌Lactobacillus helveticus 130B4用于发酵乳制品中，研究其在还原脱脂乳中的生长特性，并探讨通过添加生长促进物质对Lactobacillus helveticus 130B4生长特性以及对ACE抑制活性的影响。结果表明,Lb.helveticus 130B4菌株在还原脱脂乳培养基中生长较缓慢，产酸能力较弱，37℃培养36 h后的pH值为4.31，酸度达0.8%，活菌数为8.93 g-1；72 h后的pH值为3.45，酸度可以达到1.85%，活菌数达9.1g-1；酵母浸膏、大豆肽、核酸关联物质对该菌株的产酸能力有一定的促进作用。

发酵乳；Lactobacillus helveticus 130B4；ACE抑制活性

0 引言

近年来发酵乳制品的医疗保健作用日益受到关注，研究发现多种发酵乳制品具有降血压，抑制肿瘤等生理功能。在众多的乳酸菌中，瑞士乳杆菌(Lb.helveticus)有较强的蛋白水解活性，能水解乳蛋白产生多种活性肽，其发酵乳具有较高的抗高血压、抑制肿瘤、降低胆固醇等作用[1，2]。

血管紧张素转换酶（ACE）可以切除血管紧张素I的羧端His-Leu二肽，形成升血压活性较强的多肽——血管紧张素II[3]，ACE将具有降压功能的舒缓激肽降解,使之失去降压作用[4]。而降压肽能够抑制ACE的活性，使血管舒张,起到降血压作用[5]。本文将Lb.helveticus 130B4菌株用于发酵乳制品，探讨了其在还原性脱脂乳的生长特性，并通过添加促长因子对Lb.helveticus 130B4生长特性以及对ACE抑制活性的影响进行研究，为生产降血压的瑞士乳杆菌发酵乳奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

菌株Lb.helveticus 130B4。

脱脂乳粉；血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)、马尿酰组氨酰亮氨酸（Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine，HHL）及邻苯二甲醛（o-phthaldialdehyde,OPA）；酵母浸膏，大豆肽，核酸关联物质（腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤）；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 菌株的活化和发酵乳的制备

将瑞士乳杆菌冻干粉在无菌操作条件下，接种到MRS液体培养基中，37℃培养至浑浊，并转接3次进行活化。

将活化好的菌种转接100 g/L(质量浓度)的灭菌脱脂乳中；37℃培养0，12，24，36，48，72 h后分别取样测定其pH值、滴定酸度、活菌数蛋白水解活力和ACE抑制率。

1.3 活菌数测定

采用平板菌落计数法[6]。

1.4 pH值的测定

用经过标准缓冲溶液标定的实验室PHSJ-4A型pH计进行测定。

1.5 酸度的测测定

采用NaOH滴定法[7]。

1.6 Lb.helveticus 130B4的蛋白质分解活性

蛋白质分解活性是指脱脂乳培养基中通游离的表皮生长因子的氨基酸和寡肽的增加量，参考Church的邻苯二甲醛（OPA）方法[8]

1.7 Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性性

测定参照在Cushman等[9]方法并根据具体情况进行了一定的修改，具体方法如下：

取40 μL样品，与浓度为10 mmol/L的HHL作底物的0.1 mol/L硼酸缓冲液（浓度为0.3 mol/L的NaCl,pH值为8.3）40 μL混合，在(37士0.5)℃恒温水浴中预热3 min,后加人40 μL ACE酶液（0.01 U/mL），将混合液在37℃保温30 min,然后在沸水浴中加热10 min，再加入180 μL浓度为0.01 mol/L的EDTA溶液。同时用40 μL的硼酸缓冲液（pH值为8.3）替代抑制剂溶液作为空白对照组。HPLC色谱分析条件：4.6 mm×150 mm ZORBAX-C18柱；检测波长为228 nm；流速为1.5 mL/min；上样量：20 μL，自动进样；洗脱液：超纯水-乙腈(75%:25%，各含0.3%的冰醋酸)；柱温为30℃。ACE受到抑制会使马尿酸的产量减少，以马尿酸产量相对于空白实验减少的百分率代表ACE抑制活性。ACE抑制活性计算公式为

ACE抑制活性=〔（Cc-Cs）/(Cc-Cb)〕×100%，

式中：Cc为不含样品，但含有ACE溶液中马尿酸的峰面积，即对照；Cs为含有样品和ACE溶液中马尿酸的峰面积；Cb为样品与ACE都不存在时溶液中马尿酸的峰面积，即空白。抑制50%的ACE活性所需抑制剂的浓度记为IC50

1.8 Lb.helveticus 130B4促长因子的探讨

据报道在脱脂乳培养基中添加氨基酸和核酸关联物质时可以促进乳酸杆菌的生长[10，11]。本文选择氨基酸和寡肽含量较多的酵母浸粉、大豆肽以及腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤等核酸关联物质按一定量分别添加到脱脂乳培养基中，接种Lb.helveticus 130B4后测定不同发酵阶段的pH、酸度、蛋白质分解活性和ACE抑制活性。

2 结果与讨论

2.1 Lb.helveticus 130B4还原脱脂乳的生长特性

将Lb.helveticus 130B4在MRS液体培养基中进行3代活化后，按1.0%的量接种到10%的还原脱脂乳，在37℃的温度下进行培养。在培养0，12，24，36，48，72 h后对其pH值、滴定酸度、活菌数进行检测，结果如图1所示。

图1 Lb.helveticus 130 B4还原脱脂乳的生长特性

图1中，Lb.helveticus 130B4菌株在还原脱脂乳培养基中生较缓慢，在培养到24 h的时候，pH值为5.20，生成底物酸度仅为0.39%，培养至36 h的酸度达0.8%，72 h后可以达到1.85%。

2.2 Lb.helveticus 130B4生育性及添加促长因子的影响

将活化了的Lb.helveticus 130B4菌种分别接种到质量分数为1.0%酵母浸膏、1.0%大豆肽和5 g/100 L核酸关联物质（腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤）的10%还原脱脂乳培养基中，在37℃培养0，12，24，36，48，72 h后对其pH值、滴定酸度变化，结果如图2和图3所示。

由图2和图3可以看出，酵母浸粉、大豆肽添加到质量分数为10%还原脱脂乳培养基中，可以促进Lb.helveticus 130B4的生酸性。如，培养24 h后pH值为5.2，酸度为0.39%；添加酵母后pH值为4.85，酸度为0.62%；大豆肽添加后pH值为4.68，酸度为0.96%。这种酵母和大豆肽中含有游离的氨基酸和寡肽类活性物质，可以提供Lb.helveticus 130B4增殖所需的营养成份。在培养了48 h后，添加了酵母和大豆肽的培养液和没有添加的是有一定的区别的。

图2 Lb.helveticus 130B4的pH值及添加促长因子的影响

图3 Lb.helveticus 130B4的生酸性及添加促长因子的影响

核酸关联物质包括腺嘌呤（Adenine）、鸟嘌呤（Guanine）、尿嘧啶（Uracil）、黄嘌呤（Xanthine），黄嘌呤对Lb.helveticus 130B4的生长有明显的促进作用。对照培养24 h和培养36 h图示的pH值和酸度有较大的差别。在Lb.helveticus 130B4培养的初期阶段，其蛋白的分解能力较弱，黄嘌呤的生长促进作用也较弱，培养48 h后，以降解瑞士乳杆菌而分解生成生长的必要物质十分充足，因而反应也趋于完善。

2.3 Lb.helveticus 130B4的蛋白质分解活性

使用Lb.helveticus 130B4菌株，将质量浓度为5 g/100 L的腺嘌呤（Adenine）、鸟嘌呤（Guanine）、尿嘧啶（Uracil）、黄嘌呤（Xanthine）4种核酸关联物质、质量分数为1.0%的酵母浸粉和1.0%的大豆肽分别添加到质量分数为10%的还原脱脂乳培养基中进行接种，培养12，24，36，48，60，72 h后，测定得到的氨基酸、寡肽类物质质量分数变化如图4所示。

由图4可以看出，24 h之内，由于添加的酵母和大豆肽中含有游离的氨基酸和寡肽类活性物质，所以吸光值较添加核酸关联物质高,培养12 h后，在培养基中添加了腺嘌呤、黄嘌呤后产生的氨基酸和寡肽类物质含量急速增加，24 h到36 h时间内则都以倍数增加。酵母浸粉、大豆肽及核酸关联物质加入Lb.helveticus 130B4菌株的发酵乳中，其产生的分解活性可以促进的Lb.helveticus 130B4分解。其中，黄嘌呤对Lb.helveticus 130B4分解活性有较强的促进作用。

2.4 Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性

具有ACE抑制活性也是Lb.helveticus 130B4重要特性之一，由于黄嘌呤对Lb.helveticus 130B4的生长特性有较强的促进性，所以添加质量浓度为5 g/100 L黄嘌呤到10%还原脱脂乳培养基中，Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性的调节结果如图5所示。

由图5可以看出，还原脱脂乳培养基中添加黄嘌呤后，ACE制活性明显增强，在培养48 h活性达到64.27%，比没添加时ACE抑制活性提高了14.75%。添加黄嘌呤可使乳酸菌的蛋白质分解能力增强，发酵乳中的游离氨基酸和寡聚肽的含量增多，培养液中具有ACE抑制活性的短肽含量也随之增多。

图4 游离氨基酸、肽类质量分数的变化（OD）

3 结论

图5 Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性

将Lb.helveticus 130B4菌株接种于还原性脱脂乳培养基中，在37℃下培养，生长较缓慢，产酸能力较弱，36 h后的pH值为4.31，酸度达0.8%，活菌数8.93 g-1；72 h后的pH值为3.45，酸度可以达到1.85%，活菌数达9.1g-1；酵母浸粉、大豆肽、核酸关联物质对该菌株的产酸能力有一定的促进作用。发酵液中游离氨基酸含量明显较没添加时增多，24 h到36 h时间内则都以倍数增加；还原脱脂乳培养基中添加黄嘌呤后，ACE抑制活性明显增强，在培养48 h活性达到64.27%，比没添加时ACE抑制活性提高了14.75%。

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Study on the growth characteristics and promoting growth factors of probiotic Lactobacillus helveticus 130B4 in milk

LI Yan1,LI Yong-le1,LI Chuan-juan1,LI Xiu-li1,SHUANG Quan1,MIYAMOTO TAKU2
(1.College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China；2.Okayama University School of Natural Science and Technology Japan Okayama 700-8530）

ACE inhibitory activity of lactic acid bacteria Lactobacillus helveticus 130B4 was used in fermented dairy products,in order to reseach the growth characteristics,the growth characteristics and ACE inhibitory activity of Lactobacillus helveticus 130B4 were studied by the addition of growth promoting substances.The results showed that Lb.helveticus 130B4 in skim milk was growing slowly and weak acid,37℃for 36 h,the pH was 4.31,the acidity was 0.8%,the viable count was 8.93 g-1;after 72 h,the pH was 4.31,the acidity was 1.85%,the viable count was 9.1 g-1;the acid production ability of this strain could be promoted by Yeast leaching powder、Soybean peptide and nucleic acid related material

fermented milk；Lactobacillus helveticus 130B4；ACE inhibitory activity

Q935

A

1001-2230（2011）02-0006-03

2010-10-22

李艳（1984-），女，硕士，从事乳品生物技术方面的研究。通讯作者：双全