复方三芪提取物对NMDA致大鼠视网膜损伤的保护作用

刘 敏,王俊贤,李玉桑,宋一倩,蓝丽萍,唐和斌

(中南民族大学药学院,武汉430074)

复方三芪提取物对NMDA致大鼠视网膜损伤的保护作用

刘 敏,王俊贤,李玉桑,宋一倩,蓝丽萍,唐和斌＊

(中南民族大学药学院,武汉430074)

目的:研究复方三芪提取物对由N-甲基-D天门冬氨酸(NMDA)诱导的大鼠视网膜损伤模型的保护作用.方法:20只SD大鼠随机分为5组:正常对照组、模型组、复方三芪提取物低、中、高剂量组.模型组和给药组大鼠于右眼玻璃体内注射2μL 40 nmol·L-1NMDA,制备视网膜神经元损伤模型.给药组在NMDA注射前7 d起给予复方三芪提取物灌胃(3.903,7.805,15.61 g·kg-1.B.W.);正常对照组和模型组则给予等剂量的生理盐水灌胃.注射NMDA 7 d后静脉取血,测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量,取眼球组织,切片HE染色,观察视网膜厚度,并对视网膜视神经节细胞层(RGCL)神经元进行计数.结果:模型组大鼠RGCL神经元个数为正常组大鼠的51±6%.同模型组相比,复方三芪提取物(3.903,7.805,15.61 g·kg-1.B.W.)能剂量依赖性地增加RGCL神经元个数(P＜0.05),依次为正常组的69±6%,89±7%,103±7%.复方三芪提取物(7.805 g·kg-1.B.W.)显著提高大鼠血清SOD活性并降低MDA含量(P＜0.001).结论:复方三芪提取物能抑制NMDA诱导的视网膜脂质过氧化,并能阻止大鼠视网膜神经元进行性丢失,对NMDA诱导损伤的大鼠视网膜有修复作用.提示复方三芪提取物可能具有促进神经元的再生作用.

复方三芪提取物;视网膜;N-甲基-D天门冬氨酸;视神经保护

视网膜疾病对视力的危害日益严重.约有一半患者丧失视力,是临床亟待解决的问题.在某些眼病中,视神经元的损伤主要是由于兴奋性氨基酸受体如N-甲基-D天门冬氨酸(NMDA)受体被过激活[1-2],导致大量过氧化脂质产物如丙二醛(MDA)生成,超氧化物歧化酶(SOD)活性抑制,同时诱导视网膜视神经节细胞层 (RGCL)神经元凋亡[3].RGCL神经元在视神经损伤时的逆行性退变、死亡是导致视功能不可逆性损害的主要原因[4].以往的研究认为成年哺乳动物的视神经损伤后不能再生,然而2007年O sakada等发现神经元在体内外均可被诱导再生[5].然而迄今为止尚无肯定疗效的视网膜疾病治疗药物.复方三芪提取物中的三七,黄芪[6-7]能抗氧化,调节微循环,对视网膜损伤具有潜在的治疗作用.麦冬消炎抗菌,黄精可明目,用于辅助治疗.我们在中山大学中山眼科中心经验方“益气明目口服液”[8-9]的基础上,运用现代药理学方法对组方药物进行提取、优化,研制出复方三芪提取物.本实验采用NMDA诱导建立大鼠视网膜神经元损伤模型,对RGCL神经元进行计数,观察复方三芪提取物对大鼠视网膜神经元损伤的保护作用,并检测大鼠血清中SOD的活性和MDA的含量,探讨其作用原理.

1 实验材料

1.1 动物及分组

Sprague-Daw ley健康大鼠,20只,雌雄各半,体重170～190 g,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.随机分为5组:正常对照组、模型组、复方三芪提取物低、中、高剂量组,每组4只.饲养条件为:饲养于48 cm×35 cm×24 cm的鼠笼中,4只/笼;12 h交替照明(从早上7时开始照明),室温保持在25±1℃,湿度为60%～70%,自由获取水和食物.所有的动物实验和处理均遵照"The Guidelines for the Care and U se of L aboratory A nimals".

1.2 实验仪器及试剂

切片机(德国,L eica Rm 2265);石蜡包埋机(德国,L eica EG0050H);显微镜系统(日本,N ikon Eclipse T i);高速台式离心机(上海,安亭TGL-20B).

NMDA(sigma公司,美国);戊巴比妥钠(merk,德国);硫酸阿托品(安阳九州药业,批号0906041);地塞米松磷酸钠滴眼液(武汉五景药业有限公司,批号09030101);诺氟沙星滴眼液(武汉五景药业有限公司,批号09040701);氯化钠(sigma公司,美国);SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20100116);MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20100116);福尔马林(sigma公司,美国);实验用水为超纯水.

复方三芪提取物的制备:复方包含黄芪(内蒙古,批号101126),三七(云南,批号091101)等8味药,其中黄芪等4味中药采用水提醇沉法,三七等4味中药采用70%乙醇提取3次,浓缩合并提取物,干燥备用.

2 方法

2.1 给药

动物适应环境一周后,分别给予复方三芪提取物低、中、高剂量组大鼠灌胃复方三芪提取物,剂量分别为3.903,7.805和15.61 g·kg-1(生药总量换算),正常对照组和模型组则给予等剂量的生理盐水灌胃.每天灌胃1次,给药时间为14 d.

2.2 造模及处理

给药7 d后制备大鼠视网膜神经元损伤模型.各组大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠(10 mL·kg-1.B.W.)麻醉,双眼滴入硫酸阿托品扩瞳,根据Kawasaki等采用的方法略为改进[10-18],具体方法为:采用尖头微量注射器于模型组和复方三芪提取物低、中、高剂量组的大鼠右眼玻璃体内注射NMDA(2 μL 40 nmol·L-1).手术后,继续饲养并给药,每天采用地塞米松磷酸钠滴眼液和诺氟沙星滴眼液处理(1次/d),以预防感染.

NMDA处理后第7 d处死各组大鼠.静脉取血,采用试剂盒提供的相应方法测定血清样本中的SOD活性和MDA的含量.摘取双眼眼球组织浸入福尔马林固定液中,24 h后用流水冲洗3 h,然后梯度乙醇脱水、常规石蜡包埋、切片和HE染色处理,每只大鼠任意选取5张切片,每个切片随机选取3个视野,于显微镜下观察视网膜厚度并对RGCL神经元进行计数.计数方法:同一倍率下,记录视野中神经节细胞层长为160μm(长度以标尺为准,平行于神经节细胞层方向)的任意区域内神经元个数,取平均值.

2.3 数据统计与分析方法

采用了SPSS 11.5统计分析软件处理,进行t-检验.数据以±SD表示.P＜0.05表示有显著差异.

3 结果

3.1 HE染色切片RGCL神经元计数

如图1可见,同正常组相比(图1.A),模型组的大鼠RGCL神经元数量显著减少(图1.B).计数表明:模型组RGCL神经元个数为正常组的51%±6%.同模型组相比,复方三芪提取物(3.903,7.805,15.61 g·kg-1)剂量依赖性地增加RGCL神经元个数(P＜0.05),计数结果显示:同一倍率下单位区域内RGCL神经元数目依次为正常组的69%±6%,89%±7%,103%±7%(表1).模型组的大鼠视网膜神经内核层细胞(组织中间致密层)亦有丢失,外核层(组织下方致密层)出现空泡(图1.B).复方三芪提取物(3.903,7.805,15.61 g·kg-1)明显改善各层细胞丢失(图1.C-E).

图1 复方三芪提取物对大鼠视网膜损伤的影响Fig.1 Effect of Compound Sanqi Extract(CSE)on retina damage in rats

表1 复方三芪提取物对大鼠视网膜视神经节层神经元数目的影响Tab.1 Effect of CSE on the number of RGCL neurons in rats

3.2 SOD活性和MDA含量

上述RGCL神经元的计数结果表明复方三芪提取物(3.903,7.805,15.61 g·kg-1)剂量依赖地增加RGCL神经元个数.为了研究复方三芪提取物是否可以促进机体的损伤修复,我们选定疗效明显的复方三芪提取物(7.805 g·kg-1)中剂量组为检测对象,测定了该组大鼠血清中的SOD活性及MDA含量,并同正常组和模型组相比较,明确复方三芪提取物的全身抗氧化作用.结果显示:与正常对照组相比,模型组的大鼠血清中SOD活性明显降低(P＜0.05);复方三芪提取物(7.805 g·kg-1)具有增加SOD活性趋势.同正常对照组相比,模型组的大鼠血清中MDA含量显著升高(P＜0.001);复方三芪提取物组(7.805 g·kg-1)的大鼠MDA含量均显著降低.复方三芪提取物组(7.805 g·kg-1)的大鼠血清SOD/MDA值明显地高于模型组(P＜0.001),结果见表2.

表2 复方三芪提取物对大鼠血清中SOD活性和MDA含量的影响Tab.2 Effect of CSE on SOD activity andMDA level of rat serum

4 讨论

氧自由基广泛存在于各种生物体中,性质活泼,可与生物大分子,特别是细胞膜上的不饱和脂肪酸结合,形成脂质过氧化物,破坏生物膜.SOD是生物体内专一清除超氧阴离子自由基(O-2)的特异性抗氧化酶,可有效清除体内过多的O-2,以保持O-2的动态平衡,阻断由过多O-2所引起的一系列氧自由基病理反应[10].MDA是超氧化物阴离子自由基作用于生物膜磷脂结构不饱和脂肪酸所形成的终产物之一,其产生的量与氧自由基的量相平衡,其含量多少可间接反应自由基对组织细胞损伤强度,因而测定MDA的量可反映氧自由基的含量,在一定程度上可反映组织细胞损伤的程度.同时,MDA为一种重要的大分子交联剂,能交联蛋白质与核酸,使DNA发生突变,影响信息传递、转录和复制,从而导致蛋白质合成能力的下降或合成蛋白质功能紊乱,同时使自由基清除剂的关键酶SOD生成减少、活性降低,从而导致视网膜组织损伤[11].

其导致的视网膜内层毒性主要体现在RGCL神经元数量减少及视网膜变薄[12-16].视神经由RGCL神经元的轴突汇集组成,RGCL神经元与轴突数目间存在对应关系.通过对RGCL神经元的计数分析,可以判断NDMA所致损伤的严重程度[17-18].

本研究通过对血清中的SOD活性和MDA含量的分析发现,复方三芪提取物在大鼠体内减少过氧化产物并提高抗氧化酶活性,有效清除体内的自由基,阻止自由基对视网膜细胞组织的氧化损伤,维持的机体正常代谢.并且视网膜的HE染色结果显示:给予NMDA损伤后,大鼠RGCL神经元数目严重减少,内核层细胞丢失,在外核层出现大面积空泡.同NMDA诱导视网膜损伤模型大鼠相比,复方三芪提取物的给药处理能有效地阻止NMDA诱发的大鼠RGCL神经元数量减少,使视网膜内核层及外核层细胞恢复或保持正常水平.说明复方三芪提取物能通过增强机体抗氧化能力,对NMDA损伤的大鼠视网膜神经元进行修复,有效地保护了视网膜组织.本研究中,复方三芪提取物对视网膜损伤的改善很可能是发挥多靶点的整体协同效应,阻止视神经节细胞的病理进行性丢失,促进神经节细胞再生.其保护视网膜神经元机制有待于更深入的研究.

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Neuroprotective Effect of Compound Sanqi Extract on Rat Retinal Damage Induced by N-M ethyl-D-Aspartate

L iu M in,W ang J unx ian,L i Yusang,S ong Y iqian,L an L ip ing,T ang H ebin
(College of Pharmacy,South-centralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

W e investigated the neuroprotective effect of Compound Sanqi Extract(CSE)using a rat model of retinal damage induced by N-methyl-D-aspartate(NMDA)in the present study.Twenty Sprague-Daw ley rats were divided into five groups:Control group,NMDA group and three CSE groups.The rats in NMDA group and CSE groups received intravitreal injection of NMDA (2 μL 40 nmol·L-1).Rats in CSE groups were orally given different dosages of CSE(3.903,7.805 and 15.61 g·kg-1.B.W.)seven days before NMDA treatment.Rats in the control andNMDA group received oral saline.Results showed that the percentage of neuron numbers in retinal ganglion cell layer(RGCL)greatly increased in a dose-dependent manner(69±6%,89± 7%and 103±7%of control)after the seven days treatment w ith CSE as compared w ith NMDA group(51±6%of control,P＜0.05).In addition,the treatment of ratsw ith oral adm inistration of 7.805 g·kg-1CSE for seven days significantly increased superoxide dismutase(SOD)activity and decreased malondialdehyde(MDA)level in the serum as compared w ith NMDA group(P＜0.001).These findings indicated that CSE can reduce the NMDA-induced lipid peroxidation of rat retina by improving SOD activity and inhibitingMDA production,and which may stop the loss of retina ganglion cells and repair the damaged retina.

Compound Sanqi Extract;Retina;NMDA;Retinal neuron protection

R966

A

1672-4321(2011)01-0054-05

2011-01-22 ＊通讯作者 唐和斌(1970-),男,教授,博士,研究方向:药理学,E-mail:hbtang2006@yahoo.cn

刘 敏(1983-),女,讲师,博士,研究方向:神经药理学,E-mail:lium in831016@tom.com

国家自然科学基金资助项目(81070887);中南民族大学基本科研业务费专项资金项目(CZQ 10011);中南民族大学科学研究基金(XTZ10001)