酒花黄酮提取工艺和含量测定

李 敏，杨建华，李 渊，胡君萍,*

(1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆 乌鲁木齐 830011)

酒花黄酮提取工艺和含量测定

李 敏1，杨建华2，李 渊1，胡君萍1,*

(1.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆 乌鲁木齐 830011)

建立酒花黄酮的提取方法和含量测定方法。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法，以芦丁为对照品，通过单因素试验和L9(34)正交设计确定酒花黄酮的提取方法，并测定和比较酒花、酒糟和啤酒中黄酮的含量。结果表明：酒花黄酮提取方法为样品加入50倍的甲醇，超声提取2次，每次1h，酒花黄酮含量为69.98mg/g，酒糟和啤酒中黄酮的含量较低。对照品芦丁在10.2～40.8μg/mL质量浓度范围内与吸光度呈良好线性关系，平均回收率99.33%，RSD=3.60%。该提取方法合理，含量测定方法简便、快速、准确，可用于酒花黄酮提取物制备及其质量控制。

酒花；黄酮；提取工艺；含量测定

啤酒花Humulus lupulusL.是桑科(Moraceae)葎草属(HumulusLinn.)多年生草质蔓生藤本植物，其雌性球穗花序简称酒花[1]。酒花是一种使用历史悠久的药食同源植物，不仅用于啤酒的酿制，还具有抗菌和镇静作用，传统医学用作结核病、麻风病、神经衰弱症的治疗[2-3]。酒花原产欧洲，主产地分布于美国、欧洲、澳大利亚、南美洲和中国，我国新疆天山、阿尔泰山的山坡林间有大量野生分布，在东北、华北有栽培[4]。酒花富含树脂、挥发油、多酚、黄酮等多种生物活性成分，其中黄酮类成分(酒花黄酮)是代表酒花多种生物活性的一类重要物质。酒花黄酮包括黄

酮醇糖苷和异戊二烯查尔酮两类，前者主要包括黄芪苷、异槲皮素、芸香苷、山柰酚苷等成分，具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等活性[5]；后者包括黄腐酚、异黄腐酚、异戊二烯基柚皮素等成分，为酒花所特有，具有预防癌症和抑制癌细胞扩增[6-9]、抗病毒[10]、抗菌[11]、抗氧化[12]及雌激素样作用[13]。酒花黄酮结构类型多样、生物活性显著、在啤酒花中含量高、药食用途广泛，显示了良好的开发利用前景。新疆是酒花的主产区，酒花资源丰富，但其药用价值尚未得到有效开发。本实验建立酒花黄酮的提取工艺和含量测定方法，比较不同酒花样品的黄酮含量，为进一步制备酒花黄酮提取物及其功能性开发利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

颗粒酒花(产地新疆吉木萨尔县)经新疆医科大学药学院胡君萍副教授鉴定为啤酒花Humulus lupulusL.；啤酒花及酒糟样品干燥，粉碎，过40目筛，冷藏备用。颗粒酒花、酒糟、啤酒 新疆乌苏啤酒厂。

芦丁标准品 中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、9 5%乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮(均为分析纯)。

ST-02A型多功能粉碎机 永康帅通工具有限公司；AB104-N电子天平 上海Mettler Toledo公司；SX721分光光度计 山东高密分析仪器厂；KQ300DE型数控超声清洗机(功率300W，频率400kHz) 昆山市超声仪器有限公司；KD-S2.4数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 酒花黄酮测定原理[14]

在黄酮类化合物溶液中加入铝离子试剂后，黄酮类化合物中的酚羟基与铝离子生成络合物，控制适宜的pH值，所生成的络合物在可见区能获得特征吸收峰，其质量浓度与吸光度符合比尔定律，其颜色深浅与黄酮类化合物的量成一定的比例关系，可以定量测定。

1.2.2 对照品溶液的配制

精密称取干燥至质量恒定的芦丁对照品25.5mg，置于50mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度0.51mg/mL的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

精密称取颗粒酒花粉末1g、酒糟粉末3g，加入50倍体积的甲醇溶液，超声提取2次，每次1h，过滤，合并滤液，浓缩，定容至50mL，摇匀，即分别制得酒花供试品溶液和酒糟供试品溶液。

啤酒临用前超声20min去除泡沫，即得啤酒供试品溶液(每100mL啤酒的质量为4.1382g)。

1.2.4 测定波长的选择

精密吸取酒花供试品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6min后加入10% Al(NO3)3溶液0.3mL，放置6min，再加入10%NaOH溶液4.0mL，摇匀，用溶剂稀释至刻度，摇匀。以溶剂代替供试品溶液同法制备空白对照，15min后扫描200～800nm波长范围的吸光度，确定最大吸光度在510nm，因此分光光度法选择510nm为测定波长。

1.2.5 标准曲线的制备

精密量取芦丁对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于10mL容量瓶中，分别加入5%NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6min后加入10% Al(NO3)3溶液0.3mL，放置6min，再加入10% NaOH溶液4.0mL，摇匀，用溶剂稀释至刻度，15min于波长510nm处测定吸光度。以质量浓度C(μg/mL)为横坐标、吸光度A为纵坐标，建立标准曲线，得回归方程：A=0.0108C－0.023，r=0.9985，表明芦丁在10.2～40.8μg/mL质量浓度范围内与吸光度呈良好线性关系。

1.2.6 精密度实验

精密吸取酒花供试品溶液0.3mL，按1.2.5节方法测定吸光度6次，其RSD为2.46%。

1.2.7 稳定性实验

精密吸取酒花供试品溶液0.3mL，按1.2.5节方法，每隔0.5h测定1次吸光度，共测5次，计算吸光度的RSD为1.33%，表明显色液在2.5h内较稳定。

1.2.8 重复性实验

精密吸取0.3mL酒花供试品溶液6份，按1.2.5节方法测定吸光度，计算结果的RSD为2.00%。

1.2.9 回收率实验

精密吸取酒花供试品溶液9份各0.15mL，分别加入对照品溶液(0.51mg/mL)0.2、0.4、0.6mL，按1.2.5节方法测定吸光度，计算回收率和RSD。结果见表1。

表1 回收率实验结果Table 1 Results of recovery rate experiments

1.2.10 酒花黄酮提取工艺优化

在建立酒花黄酮含量测定方法的基础上，采用单因素试验筛选了酒花黄酮的5种提取溶剂(水、乙醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯)和4种提取方法(冷浸法、回流法、索式提取法和超声法)；并采用L9(34)正交设计，考察了溶剂体积、提取时间和提取次数对酒花黄酮含量的影响，优化并确定了酒花黄酮的最佳提取工艺。

1.2.11 样品中黄酮含量测定

按1.2.3节分别制备酒花、酒糟和啤酒供试品溶液各6份，精密吸取酒花供试品溶液0.3mL、酒糟供试品溶液4.0mL、啤酒供试品溶液4.0mL，按1.2.5节方法测定吸光度，代入回归方程计算各供试品中黄酮的含量[黄酮含量/(mg/g)=CDV/m×100，其中C为样品溶液质量浓度/(μg/mL)，V为样品溶液稀释后总体积/mL，D为样品稀释倍数，m为样品质量/g]。

2 结果与分析

2.1 酒花黄酮提取工艺的筛选

2.1.1 提取溶剂的选择

精密称取颗粒酒花粉末1g共10份，分别加入水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯各5 0 m L，超声提取30min，过滤。精密吸取滤液1.0mL，按1.2.5节方法测定吸光度，另取25mL滤液浓缩干燥，计算浸膏得率[浸膏得率/%= 浸膏质量×2/样品质量×100]。结果见表2。

表2 不同溶剂提取液的吸光度和提取率(n=2)Table 2 Absorbance and extraction rates of the extracts using different extraction solvents (n=2)

由表2可知，各溶剂对酒花黄酮提取率差异明显，以甲醇溶液的吸光度和浸膏得率为高，因此选择甲醇为酒花黄酮的提取溶剂。

2.1.2 提取方法的选择

精密称取颗粒酒花样品粉末适量，加入50倍量甲醇溶液，分别采用冷浸法(室温浸泡30min)、回流法(75℃水浴回流30min)、索式提取法(75℃水浴至提取液无色)和超声法(超声30min)提取，提取液冷却至室温，补足质量损失，过滤。分别取滤液1.0mL，按1.2.5节方法测定吸光度，另取25mL滤液浓缩干燥，计算浸膏得率。结果见表3。

表3 不同提取方法所得提取液的吸光度和提取率(n=2)Table 3 Absorbance and extraction rates of the extracts using different extraction methods (n=2)

结果表明，上述提取溶液中以超声法吸光度略高，而回流法浸膏得率略高，考虑到超声法简便易行，故采用超声法提取酒花黄酮。

2.1.3 酒花黄酮提取工艺优化

在以上单因素试验的基础上，采用L9(3)4正交设计(表4)，确定酒花黄酮最佳提取工艺。精密称取酒花样品粉末各1g，以甲醇为提取溶剂，采用超声提取法，优选溶剂体积、提取时间和提取次数，提取液过滤，滤液浓缩并定容至50mL。精密吸取上述溶液0.3mL，按1.2.5节方法测定吸光度，按回归方程计算黄酮的含量。结果见表5。

表4 酒花黄酮提取正交试验的因素和水平Table 4 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing the extraction conditions of flavonoids

表5 酒花黄酮提取正交试验结果(n=2)Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for optimizing the extraction conditions of flavonoids (n=2)

由表5极差分析可得，各因素对黄酮提取工艺的影响顺序为B(提取时间)＞C(提取次数)＞A(溶剂体积)，酒花黄酮最佳提取工艺A2B2C2，即精密称取供试品粉末适量，加入50倍体积甲醇溶液、超声提取2次、每次1h。

2.2 样品中黄酮含量测定

分别制备酒花、酒糟和啤酒供试品溶液，按1.2.10节方法测定各供试品中的黄酮含量。实验结果见表6。结果表明，上述3种样品中，颗粒酒花黄酮含量最高，其次为商品啤酒，而酒糟中黄酮含量很低。

表6 3种供试品中的黄酮含量(n=6)Table 6 Contents of total flavonoids in three samples (n=6)

3 结 论

本研究采用单因素和正交试验确定了酒花黄酮的提取工艺，即精密称取供试品粉末适量，加入50倍体积甲醇溶液、超声提取2次、每次1h。并以芦丁为对照品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定颗粒酒花、酒糟和啤酒中黄酮的含量，方法操作简便、稳定性和重现性好，对设备要求低，是检测酒花黄酮的可靠方法。

啤酒酿造企业使用的酒花制品有全酒花、酒花粉、颗粒酒花、酒花浸膏、酒花油制品等[15]。本实验的研究对象颗粒酒花是世界上使用最广泛的酒花制品，它是将粉碎至一定规格的粉状酒花压制成直径为2～8mm，长约15mm的短棒，充以惰性气体并包装，因此颗粒酒花能有效防止酒花中有效成分的氧化和损失。酒花黄酮是酒花多酚的重要组成部分[16]，本研究结果表明，颗粒酒花、酒糟和啤酒3种酒花样品的黄酮含量差异很大，其中颗粒酒花黄酮含量最高，达69.98mg/g，而酒糟中黄酮含量极低，不足颗粒酒花的1%。

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Optimization of Extraction Process and Content Determination of Total Flavonoids inHumulus lupulusL.

LI Min1，YANG Jian-hua2，LI Yuan1，.H.UJun-ping1,*
(1. College of Pharmacy, Xinjiang Medical University,..830011, China；2. Affiliated Tumor Hospital, Xinjiang Medical University, 830011, China)

Ultrasonic extraction conditions for total flavonoids fromHumulus lupulusL. were optimized by single factor experiments and orthogonal design with the aim of establishing a sample preparation method for determination of the content of total flavonoids inHumulus lupulusL. by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method using rutin as the reference. The optimal extraction process parameters were material-to-liquid ratio of 1:50, extraction duration of 1 h and repeated extraction number of 2. The content of total flavonoids fromHumulus lupulusL. was 69.98 mg/g under the optimal extraction conditions, which was much higher than that of residues and beer. The linear range was between 10.2 μg/mL and 40.8 μg/mL with a correlation coefficient of 0.9985. The average recovery rate was 99.33% with a relative standard deviation of 3.60%. The extraction and determination methods were simple and feasible, which is suitable for the preparation and quality control of flavonoids extracted fromHumulus lupulusL.

Humulus lupulusL.；total flavonoids；extraction；determination

O623.54

A

1002-6630(2011)06-0016-04

2010-04-18

新疆维吾尔自治区高校科研计划重点项目(XJEDU2009I24)

李敏(1983—)，女，讲师，硕士，主要从事天然药用植物资源的开发与利用研究。E-mail：hjp-yft@163.com

*通信作者：胡君萍(1971—)，女，副教授，博士，主要从事新疆特色药用资源的开发与利用研究。E-mail：yjh-yft@163.com