基质金属蛋白酶在动脉粥样硬化易损斑块中的分子影像学研究

丁 洁， 滕皋军

东南大学医学院，南京210009

基质金属蛋白酶在动脉粥样硬化易损斑块中的分子影像学研究

丁 洁， 滕皋军

东南大学医学院，南京210009

大量研究表明，依赖Ca2＋、Zn2＋等金属离子的基质金属蛋白酶在动脉粥样硬化斑块处的表达与斑块的稳定性密切相关，易损斑块处基质金属蛋白酶表达水平增高。单光子发射体层成像、近红外荧光成像、磁共振成像等分子影像学的方法，能够动态无创地检测动物模型动脉斑块或人颈动脉斑块切除后标本中基质金属蛋白酶的表达水平，不仅可以提示疾病的发展进程，而且能够评价药物的治疗效果。尽管大多数斑块成像的分子影像学手段尚未达到临床应用的阶段，但合成多模态的分子探针，综合运用各种不同的影像学方法将是动脉粥样硬化斑块成像的发展方向。

分子影像；基质金属蛋白酶；斑块破裂

引 言

心血管疾病日益威胁人类健康，现在普遍认为动脉粥样硬化 (atherosclerosis，AS)斑块的破裂以及随之引起的血栓形成，是心血管疾病的主要致死原因。因此，斑块性质的检测，即明确是否为易损斑块，对于患者个性化治疗方案的制定具有指导作用。分子影像学可以利用单光子发射体层成像 (single photon emission computed tomography，SPECT)、近红外荧光成像 (near-infrared fluorescence imaging，NIRF)、磁共振成像 (magnetic resonance imaging，MRI)等方法，检测AS进程中相关分子的变化，对于斑块性质的评价具有应用前景。

基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)在动脉粥样硬化发生发展过程中起着关键作用，它能够降解细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)，促进平滑肌细胞的迁移和增殖，促进粥样斑块“纤维帽”的降解，最终导致粥样斑块破裂，从而产生严重的并发症。正是因为其在AS斑块发展进程中的这一作用，MMPs作为成像靶标用于AS斑块性质的鉴定倍受关注。

MMPs的性质

MMPs是由Gross等[1](1962年)在研究蝌蚪形态改变的发育过程中第一次发现的，因其酶活性需要Ca2＋、Zn2＋等金属离子作为辅助因子而得名。MMPs是一个大家族，可由许多细胞 (如单核细胞、平滑肌细胞、泡沫细胞、T淋巴细胞等)合成并分泌至细胞外，特异性地与ECM的各种成分结合，降解ECM。在正常成人的组织中通常低水平表达MMPs，但在一些正常或病理性重建的过程中，MMPs表达上调。根据作用的底物不同，MMPs可分为胶原酶 (MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18)、明胶酶 (MMP-2、MMP-9)、基质分解素 (MMP-3、MMP-10）和膜型 MMP(MMP-14、MMP-15、MMP-16)等 4类。所有MMPs家族成员均有以下一些共同特性：1)可降解ECM成分；2)以酶原的形式分泌至细胞外，并在适当条件下激活而发挥生物学作用；3)酶的活性位点存在锌离子，并需要钙离子维持其活性与稳定性；4)pH中性时发挥作用；5)可以被特异性组织金属蛋白酶抑制因子 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMPs)所抑制。在此基础之上，MMPs成员又各有特点，各种MMPs间具有一定的底物特异性。同一种MMPs可降解多种ECM成分，而某一种ECM成分又可被多种MMPs降解，不同酶的降解效率可不同。

大量的实验研究证明：MMPs参与了人类的各种生理和病理过程，如胚胎的发育、形态学发生、血管新生、炎性反应、组织重建、器官纤维化，以及肿瘤侵袭转移等[2]。

AS易损斑块

AS是一个动态发展的过程，基本病理进程包括脂纹、纤维斑块、粥样斑块和复合性病变。典型的AS斑块主要由纤维帽和脂质核心两部分构成。纤维帽由大量平滑肌细胞和ECM形成，厚薄不一；纤维帽下为大量泡沫细胞、脂质、巨噬细胞、坏死崩解物和钙盐等物质共同组成的脂质核心。根据是否容易破溃引发心血管事件，AS斑块可分为稳定性斑块(stable plaque)和不稳定性斑块 (unstable plaque)。稳定性斑块主要由较厚的纤维组织构成、脂质核心较小、炎细胞浸润较少，此种斑易发生破裂。不稳定性斑块又称易损斑块(vulnerable plaque)，其主要的特征有：偏心性的较大的脂质核心、纤维帽薄且有大量炎细胞浸润、斑块底部有较多的新生血管。这类斑块具有破裂倾向，易于发生血栓，形成进展迅速的危险斑块[3]。可见，AS斑块的性质，即斑块的厚度、脂质和纤维帽所占比例等，将决定着斑块的稳定与否，不同性质的斑块预示着不同的结局。

MMPs与AS斑块破裂的关系

近年来的研究发现，AS易损斑块的破裂是急性冠状动脉综合征 (包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗死、心源性猝死)的主要原因[4,5]。急性冠状动脉综合征多发生在冠状动脉粥样硬化但并非冠状动脉十分狭窄的基础上，其主要病理生理机制为粥样斑块破裂、血管痉挛和随之发生的血小板黏附、聚集及继发性血栓形成。在AS易损斑块中，MMPs的合成及降解十分活跃，MMPs表达明显增多。由于平滑肌细胞凋亡，数量减少，MMPs主要来源于巨噬细胞。这一过程受到一个依赖前列腺素E2(PGE2)/环腺苷的信号通路的调节，该通路是环氧化酶2(COX-2)和前列腺素合酶信号的下游分子。即在AS易损斑块中，COX-2诱导的PGE2合成增强，PGE2可以诱导AS斑块处的巨噬细胞产生更多的MMPs。有研究证实，在发作不稳定型心绞痛和稳定型心绞痛及正常状态的内乳动脉中，MMP-9的表达分别为83%、25%及0[6]；易损斑块，尤其是斑块的肩区，MMPs活性明显增加，较稳定斑块高3～5倍；在AS斑块内和斑块的破裂处均有MMP-2及MMP-9表达。现在普遍认为，易损斑块中由于炎性细胞增多，巨噬细胞、T淋巴细胞等可大量分泌MMPs作用于ECM，加快基质、胶原纤维的降解速度，使得动脉斑块的纤维帽结构不稳定，从而促进了斑块破裂。因此MMPs的激活是导致AS斑块不稳定的重要因素[7,8]，MMPs的表达水平可以作为斑块是否稳定的一个预测指标。

MMPs在AS斑块成像中的研究

目前常采用化学检测法检测血循环中MMPs的浓度，但这种方法不能准确反应粥样硬化斑块局部MMPs的表达。正因为MMPs与AS斑块的破裂密切相关，监测斑块局部MMPs的表达情况显得十分重要。而传统的免疫组化、ELISA、Western blotting等方法存在着难以回避的局限性：需取得标本后，经过离体取材、冰冻切片及染色过程，这难以全面、系统、完整、动态地观察，更难以用于临床检测。因此，通过在体成像的方法来检测AS形成过程中MMPs的表达，活体状态下整体地追踪观察，并对同一实验对象进行长期纵向动态的研究，对于AS的预防、早期诊断、疾病的分期和治疗效果的判断具有重要的临床应用价值。

分子影像学 (molecular imaging)是在活体状态下应用影像学方法，从细胞和分子水平对生物过程进行定性和定量研究的一门新兴科学，主要有MRI、核医学成像和光学成像三种成像方法 (见表1)。通过靶向性、高亲和力的分子探针对病变分子成像，从而改变了传统医学影像学只能显示解剖学和病理学改变的形态显像能力。在AS的动物模型中，利用SPECT、NIRF、MRI等不同的成像方法，以在AS不稳定斑块中高表达的MMPs分子作为成像靶标，可以理想地监测斑块的进展并且评价药物的治疗效果。

表1 常见的分子影像学技术比较Table 1 The advantages and disadvantages of the various molecular imaging techniques

SPECT的影像学检测

Schaferas等[9]用123I或125I结合MMPs广谱抑制剂，通过SPECT成功检测了ApoE－/－小鼠动脉粥样硬化模型中活性MMPs的表达。Kopka等[10]也用125I结合MMP-2或MMP-9特异性抑制剂，通过SPECT检测到了小鼠动脉粥样硬化模型中MMPs的表达，同时还检测了I125-抑制剂复合物在体内的分布，发现药物主要分布在血循环，而且清除很快，对正常组织没有副作用。Kuqe等[11]用放射性的99Tc标记MMP-1的单克隆抗体，对兔的主动脉斑块进行成像，结果提示，在Ⅳ期斑块中，放射性探针的蓄积为对照组的5.4倍，且在不稳定性斑块中探针的蓄积也超过稳定性斑块。Fujimoto等[12]在球囊扩张和高脂饮食所致的兔腹主动脉斑块模型中，用99Tc标记MMPs的抑制剂MPI后进行SPECT成像，以评价这种非侵入性的检查方法在粥样斑块成像方面的可行性，结果发现斑块能够摄取标记核素的MPI，且用他汀类药物干预或者饮食控制脂类物质的含量后，斑块对MPI的摄取量明显降低。Satoru等[13]采用相同的兔腹主动脉斑块模型，用99Tc标记MMPs的抑制剂MPI后，发现米诺环素干预后能够持续降低斑块处MMPs的表达水平，稳定斑块，且米诺环素的治疗作用与他汀类药物相当。

NIFR成像方法

光学成像具有分辨率高、灵敏度高、价格低廉等优点，随着纳米技术的深入，基于纳米颗粒、纳米壳和量子点研发出各种类型的光学分子探针。NIFR是指靶向分子与近红外荧光染料结合得到的光学探针，可在700～1000 nm接近红外线的光区波长范围内吸收光线，随之可以发射出更大波长的光线，根据被仪器捕获的光线强度的不同来进行成像。NIFR是光学成像的一种重要手段，它的分辨率可达到1～2 mm，能穿透厚8 cm的组织，荧光成像信号强。与可见光相比，它具有两大优点：较深的组织穿透力及较弱的自发荧光。

Deguchi等[14]用NIFR成像技术，检测了ApoE－/－小鼠动脉粥样硬化模型中活性MMPs的表达，发现这种在体成像技术可成功检测动脉粥样硬化模型中活性MMPs的表达，对动脉粥样硬化病变的早期诊断、易损斑块的检测和治疗效果的判断，具有重要的临床应用价值。Wallis等[15]也通过多光谱的NIFR成像技术，用MMPs敏感的激活型探针MMPSense 680，在体外检测了患者手术切除的狭窄的颈动脉斑块，结果很好地显示出斑块处MMP的分布情况，为易损斑块的鉴别、药物治疗的效果，以及治疗方法的选择提供了很好的依据。

MRI成像方法

在动脉粥样硬化斑块的诊断中，由于具有高分辨率、无辐射、无创、可重复进行等优点，MRI检查可能成为一种理想的影像技术[16,17]。传统的MRI检查是利用斑块内本身的物理、生理学特性作为成像对比的依据，其敏感性、特异性尚有待提高。分子水平的MRI是建立在上述传统成像技术基础上，以在MRI图像上可显像的特殊分子作为成像靶点，如利用粥样斑块中某些上调的分子 〔巨噬细胞清道夫受体 (macrophage scavenger receptor,MSR)等〕，结合MRI成像对比剂，得到特异性的分子探针，对这些分子在体内进行定位。

在各类MRI对比剂中，以钆 (gadolinium，Gd)剂和超顺磁性氧化铁 (superparamagetic iron oxide，SPIO)类最受关注[18]。Gd剂能缩短被引入组织的T1驰豫时间，增强组织的T1WI信号，对T2驰豫时间的影响较小。Lancelot等[19,20]将MMPs的抑制剂与Gd剂偶联得到了MRI的分子探针P947，与非靶向性的增强剂Gd-DOTA相比，在富含MMPs斑块的ApoE-/-小鼠中，P947的聚集明显增加。结合组织学实验和MRI的体外实验也证实，无论是在高脂饮食喂养的兔的动脉斑块处还是人颈动脉斑块切除后的标本，P947均能很好地区分斑块中MMPs的含量。SPIO是近年来研究较为热门的一种磁共振增强剂，它的粒径小，穿透力强，可明显缩短T1、T2驰豫时间从而提高信噪比。同时，由于纳米颗粒的比表面积大而使其表面活性增大，更易于对纳米颗粒进行表面修饰，使其含有特定的活性基团，从而与特定的物质连接。经过修饰的纳米颗粒可具有或携带有治疗性物质，可能使治疗和诊断合二为一。且SPIO具有生物可降解性，能被细胞代谢后进入正常血浆铁池，与红细胞血红蛋白结合或用于其他代谢过程，所以在MRI分子影像学应用研究中前景看好[21]。

总 结

本文主要介绍了MMPs与AS易损斑块破裂的密切关系，及以MMPs为靶标采用不同的分子影像学方法在AS斑块成像中的实验研究结果。 MMPs在AS进程中的作用已相对明确，成为心血管病治疗的一个靶点。目前，经临床应用发现，他汀类药物及血管转化酶抑制剂可抑制MMP-9的活性，从而起到稳定斑块的作用。基因治疗方面，可以抑制MMPs的功能及抑制促进MMPs产生的有关因素，例如：应用TIMPs抑制MMPs的活性；以反义抑制的原理阻断促炎分子PGE2等的表达；通过基因敲除降低机体局部MMPs的表达，稳定AS斑块，防治心血管事件的发生。这些技术方法都必须建立在实时准确评价病灶局部MMPs的水平之上。分子影像学在动脉粥样硬化斑块的成像中具有重要的意义和广阔的前景，不断有新的对比剂被研发出来，有些已进入人体临床试验或应用，但大部分还处于临床前期的试验阶段，尚需要更加深入的研究才能达到临床应用的阶段。

不同的分子影像学检测手段各有其优缺点，单一的成像模态得到的生物体信息有限，难以满足科研及临床诊断的需要。将各种模态成像技术融合，综合运用不同的方法，合成多模态的分子探针，采用多种成像方法，将是动脉粥样硬化斑块成像的发展方向。有可能真正实现个体患者的心脑血管病危险性预测，从而采取恰当的预防和治疗措施，及时评价治疗效果，最终实现个体化的医疗。

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Molecular Imaging of Matrix Metalloproteinases in Vulnerable Plaque in Atherosclerosis

DING Jie,TENG Gaojun
School of Medicine,Southeast University,Nanjing 210009,China

Nov 1,2010 Accepted:Mar 6,2011

TENG Gaojun,Tel:+86(25)83272121,E-mail:gjteng@vip.sina.com

Many researches indicate that the expression of matrix metalloproteinases(MMPs)in atherosclerotic plaques，whose activities involved with metal ions,such as Ca2＋or Zn2＋, is closely related to the stability of the plaques.There is an increased expression level of MMPs in vulnerable plaque.Molecular imaging methods,such assinglephoton emission computed tomography,near-infrared fluorescenceimaging and magnetic resonance imaging provide dynamic and noninvasive waysin detectting the expression level of MMPs in the atherosclerosis plaque in the animal models or the tissue after carotid ectomy in patients.These methods can be used not only in prompting the progression of atherosclerosis but also evaluating the therapeutic effect of drugs.Although the majority of plaque imaging methods has not yet reached the stage of clinical application,the synthesis of multi-modality molecular probes and comprehensive use of different imaging methods will be the trend of atherosclerotic plaque imaging.

Molecular imaging;Matrix metalloproteinase;Plaque rupture

2010-11-01；接受日期：2011-03-06

滕皋军，电话：(025)83272121，E-mail：gjteng@vip.sina.com

R445.4

10.3724/SP.J.1260.2011.00312