直接竞争酶联免疫分析方法检测猪肉中的沙丁胺醇

郭柏雪，生 威，余桂春，石 曼，邓 捷，陈文洁，王 硕

(食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

直接竞争酶联免疫分析方法检测猪肉中的沙丁胺醇

郭柏雪，生 威，余桂春，石 曼，邓 捷，陈文洁，王 硕*

(食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457)

建立了一种用于检测沙丁胺醇的直接竞争酶联免疫分析(ELISA)方法，方法灵敏度(IC50)为0.80μg/L，检测限(IC15)为0.06μg/L，检测的线性范围0.06～20.00μg/L。与克伦特罗的交叉反应率为100%，与特布他林的交叉反应率为10.5%，与其他结构类似物并无明显的交叉反应，因此可以采用本实验建立的直接竞争酶联免疫方法同时测定食品中的沙丁胺醇和克伦特罗。本实验的样品处理方法简便，猪肉样品中的检测限为0.6μg/kg，添加三个浓度的样品，其添加回收率均在85%～100%之间，RSD值小于5.51%。

沙丁胺醇，抗体，直接竞争ELISA，猪肉

沙丁胺醇(salbutamol，SAL)属于β－兴奋剂类药物。近些年来由于频发因食用含克伦特罗残留的动物性食品而导致的食物中毒事件，使得各国政府都加强了对传统瘦肉精克伦特罗非法使用的监督检测力度，一些非法商贩为了牟取暴利，开始寻找新的替代品。由于沙丁胺醇促生长作用与克伦特罗类似，体内代谢时间又比克伦特罗短、毒副作用也相对较弱，于是沙丁胺醇继克伦特罗之后，成为饲料中营养再分配剂的首选品。当然，这对于广大的消费者来说存在着巨大的危害，人食用过量的含较高浓度的沙丁胺醇的动物组织后，会出现肌肉颤动、头痛、晕眩、肌痛、神经过敏、心悸、心动过速、甚至恶心、呕吐等中毒症状［1］，特别是对患有心脏缺陷病和怀孕晚期的人群具有威胁的可能性更大［2］。因此目前包括中国在内的许多国家都已将该类药物禁用。早在2002年我国农业部、卫生部就公布沙丁胺醇属于6种禁用β－兴奋剂类兽药之一，并且在肉品中的限量要求为不得检出，即含量≤0.1μg/kg［3］。因此，建立科学、高效、简便的药残监控方法十分必要。目前国内外对SAL残留检测主要采用仪器分析方法，其优点是精确度高、假阳性率低;但是这类方法检测过程繁琐、检测时间长、仪器昂贵、操作复杂，不便于现场大量样品的检测。而酶联免疫分析检测方法具有特异性强、灵敏度高、易操作、方便快捷、成本低、安全可靠等优点，是目前快速有效检测此类药物较普遍的筛选方法［4－5］。本实验建立了检测沙丁胺醇的直接竞争ELISA方法，相比常用的间接ELISA方法［6］，其检测时间更短，为进一步开发快速检测SAL的试剂盒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙丁胺醇、特布他林、异丙肾上腺素、莱克多巴胺、多巴酚丁胺标准品、福氏佐剂、牛血清白蛋白(BSA)、3，3，5，5－四甲基联苯胺(TMB) 美国 Sigma公司;包被缓冲液 0.05mol/L碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液，pH9.6;磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4) Na2HPO4·12H2O 13.76g，NaH2PO41.38g，NaCl 5g，加双蒸水至1000m L，调节pH至7.4;洗涤液(PBST，pH7.4)

5m L 10%吐温－20溶于1000m L PBS;底物液(TMB－过氧化氢脲溶液) 底物液A:取无水醋酸钠8.2g，β－糊精 2.5g，过氧化氢脲 428.6mg，加双蒸水至1000m L，调节pH至5.0，4℃保存，使用时需恢复至室温，底物液B:取100mg TMB溶于10m L DMSO中，棕色瓶保存，使用前15m in混合:14.6m L A溶液和0.45m L B溶液;终止液:1.25mol/L的H2SO4溶液;封闭液1.0%BSA/PBS溶液;免疫动物 雄性新西兰大白兔，12～16 周龄，体重1.5～2kg。

96孔酶标板 丹麦NUNC公司;蛋白纯化仪美国BIO－RAD公司;酶标仪 美国Thermo公司;微量可调移液器 法国GILSON公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备沙丁胺醇抗体及其浓度测定

1.2.1.1 免疫程序 选取月龄3个月左右，体重1.5～2kg的雄性新西兰大白兔，确定身体状况正常后进行免疫。采取多点皮下注射法进行免疫。初次免疫人工抗原的量为1mg/只，人工抗原与弗氏佐剂以1∶1比例进行乳化;分别于初次免疫后2、4、6、12周加强免疫四次，分别于第二、三、四、五次免疫完后8～10d，由兔子的耳缘静脉取血，进行抗血清效价和特异性测定。五次免疫后采用股动脉采血法采集全血。4℃进行离心，收集全部血清。

1.2.1.2 抗体的纯化和浓度测定 采用Protein ASephaorse 4B亲和层析法纯化抗体。纯化后的抗体用PBS稀释20倍，在λ=280nm处测吸光度值，以PBS为空白对照，计算出抗体浓度。

1.2.2 猪肉样品的处理 本实验选取零售的精瘦猪肉作为样品，称取2g猪肉，均质后置于50mL塑料离心管中，先加入2mL 0.1mol/L的HC1溶液，超声10min，再加入8m L PBS涡旋混合5m in，4℃(4500 r/m in)离心10m in，取上层清液用1mol/L NaOH将pH调为7.4(若有沉淀则需再离心)，将上清液用PBS稀释后用于ELISA测定。

1.2.3 直接竞争酶联免疫检测方法的建立

1.2.3.1 直接竞争ELISA的检测步骤 a.包被抗体:用包被液稀释抗体，在酶标板上加入抗体溶液(100μL/孔)，于4℃下包被过夜。然后弃去孔中液体，并用PBST洗液洗板3次。b.封闭:37℃，用封闭液(200μL/孔)封闭1h，弃封闭液并用 PBST洗液洗板3次。c.加酶标抗原:每孔先加入50μL沙丁胺醇标准品溶液或样品提取液(均溶于PBS中)，然后加入50μL酶标抗原溶液(酶标抗原溶于PBS中)，室温孵育1h，然后用PBST洗液洗板3次。d.显色:在每个孔中加入100μL底物液，于37℃下反应15m in。e.终止反应:每孔添加50μL的终止液，终止反应。f.读取OD值:在双波长方式(450～650nm)下用酶标仪读取OD值。根据吸光度值计算抑制率，如式(1)。

式中:IC%－沙丁胺醇对抗原抗体结合反应的抑制率;A对照－只添加酶标及标样稀释液的吸光度值;A样品－沙丁胺醇标准液的平均吸光度值;A空白－不加入酶标及沙丁胺醇标准液的平均吸光度值。

绘制的标准曲线:以抑制率为纵坐标Y轴，沙丁胺醇浓度对数值为X轴绘制标准曲线，是典型S型曲线。

1.2.3.2 包被抗体和酶标抗原浓度的优化 本实验采用棋盘滴定法对抗体包被量和酶标抗原稀释倍数进行优化。用包被液稀释抗体，抗体稀释倍数分别为100、200、400、800、1600 倍，包被和封闭后，加入不同浓度的酶标抗原(溶于PBS中)，酶标抗原的稀释倍数分别为 200、400、800、1600、3200、6400、12800倍，建立标准曲线，选择吸光值在1.0左右，灵敏度最好的抗体包被量和酶标抗原浓度作为最佳工作条件。

1.2.3.3 封闭液的选择以及浓度优化 按照优化工作条件，用0.5%、1.0%的脱脂乳粉和0.5%、1.0%、1.5%的BSA溶液作为封闭液，综合考虑灵敏度和吸光值两个因素，确定最佳工作条件。其他方法同1.2.3.1。

1.2.3.4 沙丁胺醇直接竞争ELISA标准曲线的建立

在优化的工作条件下，将沙丁胺醇标准品溶液稀释成不同浓度，以直接竞争ELISA法，得到不同浓度的沙丁胺醇在450～650nm时的吸光度值，根据吸光度值计算抑制率，以抑制率为纵坐标Y轴，沙丁胺醇浓度对数值为X轴绘制标准曲线，是典型的S型曲线。由标准曲线得到:抑制率为50%时的SAL浓度(IC50)即灵敏度，抑制率为15%时的SAL浓度(IC15)即检测限。

1.2.3.5 沙丁胺醇抗体特异性的测定 为了测定抗体特异性，实验选择盐酸克伦特罗(clenbuterol，CLB)，莱克多巴胺(ractopamine，RAC)、特布他林(terbutaLine，TER)、异丙肾上腺素(isoproterenoL，ISOP)、多巴酚丁胺(dobutam ine，DOB)五种 SAL结构类似物进行抗体交叉反应。以SAL的50%抑制浓度(IC50)与竞争物的50%抑制浓度之比的百分数为其交叉反应率(CR)。交叉反应率越小，则方法特异性越高。

交叉反应率(%)=IC50(沙丁胺醇)/IC50(其他药物)×100% 式(2)1.2.3.6 样品基质影响的消除 将猪肉样品按照1.2.2方法处理后所得的上清液，用PBS分别进行0倍、2倍、5倍、20倍、40倍稀释，然后分别绘制基质曲线，选择出与标准曲线基本吻合时的稀释倍数，作为最终稀释倍数。

1.2.3.7 添加回收实验 取猪肉空白样品若干份，分别添加不同浓度的沙丁胺醇标准溶液，添加浓度分别为7、24、50μg/kg，按照 1.2.2 的样品处理方法，提取后用直接竞争ELISA法检测，计算沙丁胺醇的回收率。

2 结果与分析

2.1 直接竞争ELISA检测方法的建立

抗体经纯化后，通过紫外分光光度法测得抗体蛋白的浓度为1.31g/L。经过优化确定最佳工作条件为:包被抗体稀释度为1∶800;酶标抗原稀释度为1∶1600;1.0%BSA作为封闭液。按1.2.3.1的方法操作，得到标准曲线为典型的S型曲线，见图1。如图可知，SAL直接竞争检测方法的灵敏度，即IC50=0.80±0.10μg/L;检测限，即 IC15=0.06 ±0.016μg/L。

图1 沙丁胺醇直接竞争标准曲线

2.2 沙丁胺醇抗体特异性

为了测定抗体特异性，研究了SAL抗体对5种SAL结构相似的β－兴奋剂之间的交叉反应(见表1)。结果表明，沙丁胺醇SAL与盐酸克伦特罗CLB的交叉率高达100%，与特布他林TER的交叉率为10.50%，与其他的结构类似物基本无交叉，因此可以应用本方法同时检测SAL和CLB。

表1 SAL抗体与结构类似物交叉反应(n=3)

2.3 样品基质影响的消除

将猪肉样品按照1.2.2方法处理后所得的上清液，用PBS分别进行0倍、2倍、5倍、20倍、40倍稀释，然后分别绘制基质曲线，对比与标准曲线吻合度，结果如图2所示。由图可知，猪肉样品未经稀释的上清液的基质曲线与标准曲线不能重合，说明基质影响没有消除;而上清液经过2倍稀释之后的基质曲线与标准曲线均基本吻合，说明基质影响基本消除。因此猪肉样品提取上清液经2倍稀释后可以直接用于ELISA检测。本方法猪肉样品中的检测限为0.6μg/kg。

2.4 添加回收实验结果

取猪肉样品若干份，进行回收率测定并计算RSD(Relative Standard Deviation)值，结果见表2。添加浓度分别为7、24、50μg/kg，经1.2.2 的方法处理猪肉样品，按照优化后的工作浓度进行检测，其回收率在85%～100%之间，且RSD小于5.51%，表明本实验建立的直接竞争ELISA有较好的准确性，可以用于猪肉样品中沙丁胺醇的检测。

图2 猪肉样品基质影响－抑制率曲线

表2 添加回收实验(n=3)

3 结论

本实验制备了沙丁胺醇多克隆抗体，建立了一种用于检测沙丁胺醇的直接竞争ELISA方法，方法灵敏度(IC50)为 0.80μg/L，检测限(IC15)为 0.06μg/L，检测的线性范围为0.06～20.00μg/L。抗体与克伦特罗的交叉反应率为100%，因此可以用本方法同时测定食品中的沙丁胺醇和克伦特罗。对添加三个浓度沙丁胺醇的猪肉样品应用本方法进行检测，其添加回收率在85%～100%之间，RSD值小于5.51%。方法在猪肉样品中的检测限为0.6μg/kg。本实验建立的直接竞争ELISA方法，方法灵敏度高，样品处理方法简单，为兽药残留检测试剂盒的研究提供了借鉴。

今后，在本实验基础上可进行其他免疫检测方法的研究，如免疫传感器等，以建立更为灵敏快速的沙丁胺醇免疫分析检测方法。虽然ELISA检测方法检测出的阳性结果的准确性无法与 CG、HPLC、GC/MS方法相比，但是由于其快速灵敏的特性，在大批量样品现场快速检测时常被应用于样品的粗筛，大大缩短了检测时间，发展前景良好。初筛后检测出的阳性结果需要用其他方法(GC、HPLC、GC/MS等)进行进一步确证。

［1］邱阳生，杨根海.沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其鉴定［J］.中国兽医科技，2002，32(10):25－26.

［2］Shi－ Yuan Sheu，Yi－ Chih Lei，Yung－ Te Tai.Screening of salbutamol residues in swinemeat and animal feed by an enzyme immunoassay in Taiwan［J］.Analytica Chimica Acta，2009，654:148－153.

［3］邱阳生，杨根海，何方洋.β2－兴奋剂沙丁胺醇及其检测技术研究进展［D］.中国农业大学，2002.

［4］Hasmukh B Sheth Spoms.Development of a single ELISA for Detection of Sulfonamides［J］.Agric Food Chem，1991，39:1696－1700.

［5］Brady MSKat Z SE.Antibiotic and antimicrobial residues in milk［J］.Food Prot，1988，511:8－11.

［6］孙新海，凌红丽，王雷.沙丁胺醇残留的酶联免疫检测方法的建立［J］.中国动物检疫，2009，26(12):44－47.

Determ ination of salbutamol residue in pig muscle by direct com petitive enzyme－linked immunosorbent assay

GUO Bai－xue，SHENG W ei，YU Gui－chun，SHIM an，DENG Jie，CHEN W en－jie，WANG Shuo*
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science ＆ Technology，Tianjin 300457，China)

A direct com petitive enzyme－linked immunosorbent assays(cd－ELISA)was developed for detection of salbutam ol in pork using polyclonal antibody.The sensitivity(IC50)and lim it of detection(IC15)of assay were0.80μg/L and 0.06μg/L，respectively.The ELISA detection system had the linear detection of 0.06～20.00μg/L.All of the test com pounds，except clenbutarol(100%)and terbutaline(10.5%)，showed low cross－ reactivity.Then this direct competitive ELISA could potentially be applied to the determ ination of salbutamol and clenbutarol.The lim it of detection of this developed ELISA for salbutamol in pork was0.6μg/kg.The average recoverieswere in ranges of85%～100%and RSD were below 5.51%.

salbutamol;antibody;dc－ELISA;pork

TS207.3

A

1002－0306(2011)06－0388－03

2010－01－20 *通讯联系人

郭柏雪(1985－)，女，硕士，研究方向:营养与食品卫生学。

“十一五”科技支撑课题计划资助项目(2009BADB9B06)。