固定化β-葡萄苷酶转化甜菊糖的研究

刘 虎，陈育如，2，*，姜中玉

(1.南京师范大学生命科学学院，南京市微生物工程技术研究中心，江苏省生物多样性及生物技术重点实验室，江苏省微生物与功能基因组学重点实验室，江苏南京210046;2.南京师范大学泰州学院生物技术系、园艺系、制药工程系，江苏泰州225300)

固定化β-葡萄苷酶转化甜菊糖的研究

刘 虎1，陈育如1，2，*，姜中玉1

(1.南京师范大学生命科学学院，南京市微生物工程技术研究中心，江苏省生物多样性及生物技术重点实验室，江苏省微生物与功能基因组学重点实验室，江苏南京210046;2.南京师范大学泰州学院生物技术系、园艺系、制药工程系，江苏泰州225300)

用海藻酸钠作为包埋材料，对巨大芽孢杆菌所产β－葡萄糖苷酶进行了固定化，并对固定化酶转化甜菊糖的条件进行了研究。采用单因素分析方法探讨了温度、pH、时间、酶量、底物浓度和回收次数对转化的影响。结果表明，固定化酶在40℃、pH7.0、酶量20g/100mL时转化5d，可将1%甜菊糖(W/W)中的甜菊苷转化96.45%，固定化酶经4次重复利用后其转化活力仍能维持在原活性的57.77%，具有较好的稳定性和可回收性。该工艺操作简单、成本较低，在转化甜菊苷、提高莱鲍迪甙A纯度方面具有潜在的应用前景。

甜菊苷，固定化，生物转化，β－葡萄糖苷酶，巨大芽孢杆菌

甜菊糖为甜叶菊(Stevia rebaudiana)中所含有的主要甜味成分，是一种天然甜味剂，因其高甜度、低热值(约为蔗糖的1/300)、无毒副作用等特点，有望成为替代蔗糖的理想甜味剂［1］。甜菊糖主要成分是甜菊苷(stevioside，SS)和莱鲍迪甙A(rebaudioside A，RA)。RA甜味品质最好，但含量较SS低，而SS有一定的后苦味［2］，因此人们希望纯化RA使甜味更纯正，但RA与SS在化学性质、分子结构和极性等方面都非常接近，因而通过化学方法纯化比较困难［3］。在前期研究中，筛选的巨大芽孢杆菌具有高产β－葡萄糖苷酶能力，该酶可选择性地将甜菊苷转化，进而使RA的纯度得到提高［4］。但游离酶使用寿命低、可回收性差，限制了β－葡萄糖苷酶在甜菊苷转化中的应用。酶的固定化是用一定的材料将活性酶束缚或限制于一定的区域内，但仍能进行酶所特有的催化反应，并可回收及重复使用的一种新技术。与游离酶相比，固定化酶具有产物分离简单、可重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点，近年来在食品、制药、化学分析、环境保护等方面具有越来越广泛的应用［5］。现已报道利用海藻酸钠固定化β－葡萄糖苷酶［6－7］，巨大芽孢杆菌曾被应用于一些结构物质的微生物转化中，如转化二氢异甜菊醇［8］，利用固定化的巨大芽孢杆菌对碳氢化合物进行羟基化［9］。本工作对选育的一株巨大芽孢杆菌(CCTCC NO:M209201)所产β－葡萄糖苷酶进行了固定化，并用单因素分析方法对固定化酶转化甜菊苷的特性进行了研究，为RA纯化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

图1 甜菊糖苷分子的通用结构式

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，CCTCC NO:M209201) 本实验室分离保存［4］;菌种保藏培养基

牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH7.2;发酵产酶培养基 玉米淀粉 4%，豆粕粉1%，硫酸镁 0.04%，SS 0.2%，pH 7.0，摇瓶装液量50mL/250mL;甜菊糖(甜菊苷SS>50%) 由甜菊糖公司提供。

CA－1390－1垂直层流洁净工作台 上海净化设备有限公司;GNP－9080隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;HD－930型组合式全温摇床

江苏太仓市博莱特实验仪器厂;ES－315高压蒸汽灭菌锅 TOMY，Japan;FA1004电子分析天平 上海天平仪器厂;HH－2数显恒温水浴锅 常州国华实验仪器厂;Agilent 1100高效液相色谱仪 Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 产酶发酵培养 产酶培养基装液量50mL/250mL三角瓶，接种活化培养24h的巨大芽孢杆菌液，接种量5%，37℃、220r/min培养36h。

1.2.2 水杨苷法测定酶活性

1.2.2.1 酶液的制备 发酵36h的培养液经4000r/min离心10min得上清，即为酶液。

1.2.2.2 水杨苷溶液酶反应 0.2mL水杨苷(质量分数0.5%，0.2mol/L、pH5.0醋酸缓冲液配制)溶液，加0.2mL粗酶液，混匀于50℃下温育10min，取出立即加1mL 3，5－二硝基水杨酸(DNS)溶液，混匀后沸水浴5min，冷水冷却后，蒸馏水定容至10mL，混匀，在540nm下测定其吸光度。

1.2.2.3 活力单位定义 1mL粗酶液在pH5.0、50℃下催化反应1min产生1μg葡萄糖所需的酶量为一个活力单位。

1.2.3 酶的固定化［10］参考文献［10］方法，有所改动。将1.4g海藻酸钠与40mL β－葡萄糖苷酶溶液均匀混合(酶活力为779.68U/mL)，在37℃水浴中使海藻酸钠溶化，并使海藻酸钠溶液与酶溶液充分混匀。用5mL注射器吸取海藻酸钠与酶的混合液，以10cm左右的高度逐滴注入到质量分数2%的氯化钙溶液中，立即形成光滑的凝胶小球。滤出凝胶小球，更换氯化钙溶液，在4℃冰箱中静置硬化3h。再次滤出凝胶小球，用质量分数0.9%NaCl洗涤后，用吸水纸吸干表面水分，贮存于4℃冰箱中备用。

1.2.4 固定化酶对甜菊糖的转化 100mL 1%(W/W)甜菊糖转化液中添加20g的固定化酶，40℃、200r/min动态转化5d后，HPLC法检测转化液中甜菊糖SS的转化情况。

1.2.5 甜菊糖含量的检测 SS和RA含量HPLC法测定，色谱条件:Agilent 1100高效液相色谱仪，色谱柱为Kromasil－NH2(4.6mm×250mm)，210nm紫外检测，流动相为80%乙腈水溶液(V/V)，柱温25℃，流速1.0mL/min，时间20min。

2 结果与讨论

2.1 温度对甜菊糖SS转化的影响

在100mL 1%(W/W)甜菊糖转化液中，加5g固定化酶或相应酶活力下的酶液，在不同的温度下200r/min转化5d，考察转化温度对甜菊糖转化的影响。

由图2可见，从25℃至35℃酶转化率迅速增加，并使甜菊苷的转化率达到70.43%，从35℃至40℃转化率变化不大，在40℃时达到最大值的75.65%，之后转化率略有减少。

图2 温度对甜菊糖转化的影响

2.2 pH对甜菊糖SS转化的影响

在100mL 1%(W/W)甜菊糖转化液中，调节初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加10g固定化酶或相应酶活力下的酶液，37℃、200r/min转化5d，考察初始pH对甜菊糖转化的影响。

由图3可见，在固定化酶和游离酶两种酶状态下，SS转化率都随着pH的增大而增高，并在初始pH为7.0时，SS的转化率达到最大，在固定化和游离状态下分别达到86.47%和85.14%，而继续增大pH时SS转化率反而下降，不利于甜菊糖的转化。不同的是在使用固定化酶转化时，pH在6.0和8.0时其SS转化率均在70%以上，高于游离酶，这表明固定化酶对pH的适应性较大。

图3 初始pH对甜菊糖转化的影响

2.3 时间对甜菊糖SS转化的影响

在100mL 1%(W/W)甜菊糖转化液中加10g固定化酶，pH 7.0，30℃、220r/min转化6d，考察转化时间对固定化酶转化的影响。

由图4可见，在0至4d时，SS的转化是持续的，转化速率也相对稳定，在第5d时转化稍慢，但甜菊糖SS转化率也达到91.92%，至第6d时转化几乎停滞，可见在前5d是甜菊糖转化的主要阶段。

表1 固定化酶回收次数对甜菊糖转化的影响

图4 时间对甜菊糖转化的影响

2.4 底物浓度对甜菊糖SS转化的影响

在100mL甜菊糖转化液中加10g固定化酶，37℃、200r/min转化3d，转化液中甜菊糖浓度分别为0.1%、0.5%、1%、2%、3%(W/W)，考察底物浓度对固定化酶转化的影响。

由图5可见，在甜菊糖浓度在0.1%(W/W)时，甜菊苷的转化率最大，但转化量最小，而甜菊糖浓度为1%(W/W)时，经 3d的转化，SS减少量为4.41mg/mL，SS的转化率达到75.8%，二者均较大。另外SS/RA也由2.43降为0.81，所以选择底物浓度为1%(W/W)。

图5 底物浓度对甜菊糖转化的影响

2.5 酶量对甜菊糖SS转化的影响

在100mL 1%(W/W)甜菊糖转化液中添加固定化酶，使酶含量分别为1、5、10、20、30g/mL，35℃、150r/min转化3d，检测SS的转化量及转化率。

由图6可见，酶添加量越大，SS转化率也随之增大，但当酶量为 30g时，转化产物甜菊双糖甙(steviolbioside)的量减少，可能的原因是过多的酶使甜菊双糖甙继续转化，减少了产物的积累量。故优选酶添加量为20g/100mL，此时SS转化率和转化产物均较高。

1%(W/W)甜菊糖转化原液和转化2d的转化液HPLC图见图7和图8，图8中SS被大量转化而RA量基本保持不变，因此RA的纯度得到相对提高。产物为甜菊双糖甙可作为制备异甜菊醇和槐糖的原料，具有潜在的应用价值。

图6 固定化酶量对甜菊糖转化的影响

图7 甜菊糖原液1%(W/W)的HPLC图

图8 甜菊糖1%(W/W)经固定化酶转化2d的HPLC图

2.6 固定化酶的回收及再利用

一种固定化酶能否应用于工业生产，关键在于固定化方法要简单易行，固定化酶的活性要高，操作半衰期要长，固定化费用要低。

回收:转化液滤出固定化酶，0.9%氯化钠溶液洗涤3次后，吸水纸吸干即可。

再利用:100mL 1%(W/W)甜菊糖转化液加20g固定化酶，在最佳转化条件下(40℃、200r/min)转化5d，与初次利用固定化酶相比研究其转化SS的性能。

由表1可见，经4次的固定化酶的回收，SS转化率由 96.45%降到 55.72%，而 RA相对含量由29.19%增加到 48.19%，相对酶活力降为原来的57.77%，表明固定化酶经重复使用4次后仍保有较高的转化活力，酶活力下降的原因可能为固定化材料在反复的搅拌下，其凝胶结构发生改变致使酶产生泄漏造成的。

3 结论

本工作以海藻酸钠为包埋材料，固定化巨大芽孢杆菌所产β－葡萄糖苷酶，研究了固定化酶对甜菊糖的转化条件，通过单因素分析确定了最佳的转化条件，即温度为40℃、pH为7.0、酶量为20g/100mL、转化时间为5d，该条件下可将1%甜菊糖(W/W)中SS转化96.45%，固定化酶经4次重复利用后其转化活力仍能维持在原活性的57.77%，具有较好的稳定性和可回收性，与游离酶相比，固定化的β－葡萄糖苷酶具有更为宽泛的温度和pH适应性。该工艺操作简单、成本较低，在转化甜菊苷、提高RA纯度方面具有潜在的应用前景。

［1］李晓瑜.甜菊糖苷的安全性研究进展［J］.中国食品添加剂，2003(2):5－11.

［2］Starrat AN，Kirby CW，Pocs R，et al.Rebaudioside F，a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana［J］.Phytochemistry，2002，59:367－370.

［3］Bondarev NL，Sukhanova MA，Reshetnyak OV，et al.Steviol glycoside content in different organs of Stevia rebaudiana and its dynamics during ontogeny［J］.Biologia Plantarum，2003，47(2):261－264.

［4］陈育如，刘虎，姜中玉.一种提高甜菊糖甜质的方法［P］.中国专利:200910036066.5.2009－09－16.

［5］韩文静.固定化酶的新型制备方法及其在食品工业中的应用［J］.食品工业科技，2009，30(2):345－347.

［6］陈庆庆，夏黎明.固定化β－葡萄糖苷酶转化糖苷型异黄酮的研究［J］.高校化学工程学报，2007，21(2):304－309.

［7］王瑾，李默馨，李红玲，等.壳聚糖/海藻酸钠固定化β－葡萄糖苷酶的研究［J］.食品工业科技，2009，30(3):164－167.

［8］Yang LM，Hsu FL，Cheng JT，et al.Hydroxylation and glucosidation of ent－16 beta－hydroxybeyeran－19－oic acid by Bacillus megaterium and Aspergillus niger［J］.Planta Medica，2004，70(4):359－363.

［9］Zhekova BY，Pishtiyski IG，Stanchev VS.Investigation on cyclodextrin production with cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus megaterium［J］.Food Technology and Biotechnology，2008，46(3):328－334.

［10］赵林果，李丽娟，王平，等.海藻酸钠固定化β－葡萄糖苷酶的研究［J］.生物加工过程，2007，5(4):25－31.

Study on transformation of stevioside by immobilized β－glucosidase

LIU Hu1，CHEN Yu－ru1，2，*，JIANG Zhong－yu1
(1.Nanjing Engineering and Technology Research Center for Microbiology，College of Life Science，Nanjing Normal University，Jiangsu Key Laboratory for Microbes and Functional Genomics，Nanjing 210046，China:2.Department of Biotechnology，Department of Horticulture，Department of Pharmaceutical Engineering，Taizhou College，Nanjing Normal University，Taizhou 225300，China)

Stevioside was hydrolyzed steviolbioside using immobilized β－glucosidase produced by Bacillus megaterium.The conditions of immobilized enzymes degrading stevioside were investigated.The embedding material was sodium alginate.The optimum method was determined by the single factor analysis.The results of conversion showed that 10mg/mL stevioside can be converted to steviolbioside by 96.45%for 5d under the condition of 40℃，pH7.0，20g/100mL immobilized β －glucosidase.The activity of immobilized enzyme recovered after 4 times was 57.77%of the original enzyme，which showed high stability and recyclability.The process was simple，low cost in the transformation of stevioside and had a potential application prospects for improvement of the purity of rebaudioside A.

stevioside;immobilization;biotransformation;β－Glucosidase;Bacillus megaterium

TS201.2

A

1002－0306(2011)04－0170－04

2010－03－03 *通讯联系人

刘虎(1983－)，男，硕士研究生，主要从事应用微生物的研究。

林业公益性行业科研专项基金(200904055);江苏高校优势学科建设工程资助项目。