强直性脊柱炎患者外周血淋巴细胞亚群的检测及其临床意义

马学华,张 萱,张 娜,赵 宇,宋丽婷

(哈尔滨医科大学附属第一医院检验科,黑龙江哈尔滨150001)

强直性脊柱炎(AS)是一种慢性自身免疫性疾病,主要累及髂骶关节、脊柱、骨软骨组织及四肢关节,表现为脊柱和髂骶关节疼痛、活动障碍、畸形、关节强直而丧失劳动力。有学者研究表明外周血淋巴细胞比例失调见于系统性红斑狼疮、多发性硬化症、原发性血小板减少性紫癜等自身免疫性疾病患者[1-3],并与疾病的发生密切相关,但淋巴细胞亚群与AS关系的报道却不多见。本研究应用流式细胞术对AS患者外周血中淋巴细胞亚群进行检测分析,以探讨淋巴细胞与强直性脊柱炎发病的关系。

1 材料与方法

1.1 检测对象 2008年12月至2009年7月来我院就诊的AS患者,参照1984年修订的AS 36例诊断标准[1],符合以下3项标准:(1)腰痛持续3个月以上,活动后减轻,休息后无缓解;(2)腰椎额状面和矢状面活动受限;(3)腰廓活动度低于相应年龄、性别的正常人(＜2.5 cm);放射学标准髂关节炎为双侧≥Ⅱ级或单侧Ⅲ-Ⅳ级或仅符合放射学标准。男25例,女11例,年龄15-32岁,平均年龄23.1±4.8岁。对照组32名,男性20例,女性 12例,平均年龄25.8±3.6岁,无自身免疫性疾病及骨关节病。

1.2 主要试剂及仪器 试剂美国BD公司生产的SimulSET IMK Plus试剂盒。其中包括CD45-FITC/CD14-PE,IgG1-FITC/IgG2a-PE,CD4-FITC/CD8-PE,CD3-FITC/CD19-PE,CD3-FITC/CD16+56-PE,CD3-FITC/HLA-DR-PE 6只荧光抗体;BD FACS红细胞裂解液。用美国BD公司生产的FACSCalibur流式细胞仪检测。

1.3 方法 抽取待检患者清晨空腹静脉血2 ml,EDTA-K2抗凝。6个试管中分别加入上述6种荧光标记抗体 20 μ l,每管 100 μ l全血 ,混匀 ,室温避光静置20分钟,每管加入2 ml红细胞裂解液,混匀后室温避光反应10分钟,1 000 r/min离心10分钟,弃上清,每管加2 ml PBS洗涤,以300 μ l PBS悬浮细胞。首先用BD公司的CaliBRITE三色标准微球,通过FACSComp软件自动校准流式细胞仪,激发光波长为488 nm,然后打开SimulSET软件,获取细胞,并分别报告出淋巴细胞亚群百分比。

1.4 统计分析 以t检验比较组间结果。

2 结果

2.1 AS患者及正常人外周血T淋巴细胞亚群比例

患者组外周血中CD3+CD8+T淋巴细胞与正常对照组外周血相比明显降低(t=1.79,P＜0.05),CD4+/CD8+比值明显升高(t=1.96,P＜0.05),CD3+、CD3+CD4+T淋巴细胞均有所升高,但无显著性差异(P＞0.05)。结果见表1。

表1 AS患者T淋巴细胞亚群百分率与正常对照组比较(±s,%)

表1 AS患者T淋巴细胞亚群百分率与正常对照组比较(±s,%)

注:与对照组比较,*P＜0.05

组别 CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+CD4+/CD8+AS组 66.9±9.0 36.4±5.5 39.0±9.0* 1.1±0.3*对照组 64.3±11.7 35.5±8.8 43.9±8.4 0.9±0.5

2.2 AS患者及正常人外周血B淋巴细胞、NK细胞及活化T淋巴细胞比例

CD3-CD19+B淋巴细胞明显升高(t=2.437,P＜0.05),CD3-CD16+56+NK细胞明显降低(t=1.83,P＜0.05),CD3+HLA-DR+活化T淋巴细胞明显降低(t=2.40,P＜0.05)。见表2。

表2 AS患者B,NK及活化T淋巴细胞亚群百分率与正常对照组比较(±s,%)

表2 AS患者B,NK及活化T淋巴细胞亚群百分率与正常对照组比较(±s,%)

注:与对照组比较,*P＜0.05

组别 CD3-CD19+ CD3-CD16+56+CD3+HLA-DR+AS组 11.8±4.3* 21.5±9.6* 15.7±7.3*对照组 8.9±3.1 27.8±11.8 22.4±10.0

3 讨论

T淋巴细胞是一种重要的免疫活性细胞,根据T细胞表面分子标志物的不同将其分成不同T细胞亚群。CD3代表全部T淋巴细胞,CD4是T辅助(Th)的表面标志,CD4+T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能,在辅助、诱导细胞及体液免疫中发挥作用。CD8是抑制/杀伤 T细胞(Ts)的表面标志,CD8+T细胞具有细胞毒效应及抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体、抑制细胞免疫及体液免疫的作用。机体的相对免疫平衡状态主要由它们的相互影响来维持,两亚群细胞比例的失调就会产生免疫功能失常,因此CD4+/CD8+比值代表了整体的免疫平衡[5]。本研究显示,AS患者CD3+CD4+百分率升高,CD3+CD8+降低,CD4/CD8比例显著升高,说明AS患者T细胞免疫失衡。AS患者的B淋巴细胞(CD3-CD19+)与对照组比较有明显增高,提示B淋巴细胞在AS的发病机制中可能起到重要作用,与以往研究结果一致[6]。

NK细胞(CD3-CD16+56+)在抗病毒感染及抗变异细胞的早期起到决定作用,它们可通过释放细胞因子如INF-γ来快速杀死异常细胞。同时,NK细胞在调节自身免疫反应中起重要作用,它主要通过释放细胞因子对机体免疫功能加以调节,可抑制B细胞的分化和增殖,同时对T细胞介导的免疫功能起调节作用[7]。已有学者研究表明系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病患者外周血中NK细胞减少、功能受损[8]。本文发现AS患者NK细胞数量与对照组相比明显减少,提示具有调节功能的NK细胞选择性减少,不能有效调控自身免疫反应,导致 B细胞产生过多免疫球蛋白,可能为其发病的主要原因之一。该结果与Niva Azuz-Lieberman等人的研究结果相反[9],可能由种族或研究方法差异所致。

HLA-DR是淋巴细胞晚期的活化标志,AS患者CD3+HLA-DR+细胞明显低于正常对照组,T细胞活化功能降低,致使抑制性T淋巴细胞不能发挥其抑制效应,从而导致B淋巴细胞增加及活化,产生大量自身抗体,导致疾病的发生。

本文表明,T淋巴细胞亚群的改变和NK细胞活性降低,导致B细胞功能亢进,产生多种自身抗体,在AS的发病机理中可能起到重要的作用。淋巴细胞亚群的改变会导致哪些细胞因子的变化、采用哪类细胞因子拮抗剂来治疗AS还有待于进一步研究。

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