白毛藤全草水提取物诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡作用及其机制研究△

杨旭东，张杰，徐晓宇

(1.黑龙江省牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.黑龙江省黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150076)

药 理

白毛藤全草水提取物诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡作用及其机制研究△

杨旭东1*，张杰1，徐晓宇2

(1.黑龙江省牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.黑龙江省黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150076)

目的：探讨survivin、bax基因在白毛藤诱导人胃癌细胞凋亡中的作用。方法：不同浓度白毛藤作用于BGC-823细胞48 h后，荧光显微镜观察BGC-823细胞凋亡情况，RT-PCR法检测survivin、bax基因表达量的变化。结果：白毛藤能诱导BGC-823细胞凋亡，并且上调bax和降低survivin表达。结论：白毛藤能促进BGC-823细胞凋亡，其机制可能与激活bax、抑制survivin表达有关。

白毛藤；胃癌；细胞凋亡

白毛藤SolanumlyratumThunb.系茄科植物白英的全草，具有清热利湿、消肿解毒的功效[1]。有研究表明，其水提物有较强的肿瘤细胞增殖抑制活性[2-4]，但对其抗癌作用机理阐述并不明确。本研究拟观察白毛藤对人胃癌细胞BGC-823细胞是否具有诱导凋亡作用，并初步探讨其作用机制，为白毛藤应用于胃癌的临床治疗提供新的实验依据。

1 材料

1.1 细胞株

人胃癌细胞BGC-823细胞株(武汉中美科技有限公司)。

1.2 药物、试剂与仪器

白毛藤全草购自牡丹江保健大药房，经牡丹江医学院医学与药物研究中心袁晓环教授鉴定为S.lyratum的全草。MTT试剂(泰伦生物科技有限公司，批号：041025)；Trizol，(Sigma公司，批号：15596-018)；引物核苷酸片段(上海生工生物技术有限公司)。奥林巴斯CKX41-F32FL荧光显微镜。

1.3 药物处理

白毛藤全草干品20 g，粉碎，用400 mL双蒸水浸泡30 min，加热沸腾60 min，倒出液体留用，药渣加200 mL双蒸水再煮1次，合并两次煮出液，使其自然冷却，100目筛绢过滤，弃药渣。滤液经15 000 r·min-1、4 ℃离心20 min，上清液用冷冻干燥机冷冻干燥，将干燥物溶解于40 mL PBS，0.22 μm除菌滤器过滤除菌，得0.5 g·mL-1的棕褐色澄清透明溶液，避光冷藏，实验时再稀释为所需要的药物终浓度。

2 方法

2.1 实验分组

实验组：RPMI-1640培养液倍比稀释的4，8，16 mg·mL-1的白毛藤水提液。对照组：含BGC-823细胞的RPMI-1640培养液。

2.2 MTT比色法测定细胞增殖抑制率

收集对数生长期肿瘤细胞，调整细胞密度为1×105个·mL-1，每孔100 μL接种于96孔板中。每个剂量设12个平行孔，分别培养12,24,48 h后，加入5 g·L-1MTT 20 μL(调零组除外)继续培养；4 h后，吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解样品，采用酶标仪测定各孔490 nm吸光度(OD)值。比色时以RPMI-1640培养液调零。按公式计算细胞生长抑制率(inhibition rate，IR)。IR=(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100 %。

2.3 细胞凋亡检测

取指数生长期的癌细胞，加入适量0.25 %胰蛋白酶液消化细胞，使贴壁细胞脱落。用含10 %胎牛血清的培养基制备成浓度为3×105个·mL-1的细胞悬液，于6孔板中每孔接种1 mL。将普通洁净盖玻片置于37 ℃、5 % CO2培养箱。24 h后加入不同质量浓度的白毛藤；对照组加相同体积的培养液。48 h后细胞用胰酶消化，冷PBS(pH 7.2)洗3遍，固定液甲醇-冰醋酸(3∶1)，4 ℃固定10 min，弃固定液，蒸馏水洗3遍，室温干燥，用5 mg·L-1Hoechst 33258染色，37 ℃、5 %CO2培养箱中孵育15 min，将孔中的盖玻片取出，盖在已滴好甘油的载玻片上，置于荧光倒置显微镜上观察细胞形态并拍照。随机选取10个视野拍照后计数其凋亡细胞与正常细胞，凋亡率=[凋亡细胞/(凋亡细胞+正常细胞)]×100 %。

2.4 细胞凋亡检测

取肿瘤细胞总RNA，用RT-PCR方法检测肿瘤细胞survivin、bax基因表达。设计引物如下：survivin引物，上游：5′-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3′；下游：5′-AGCCAGTCCCCCACAGCAT-3′，扩增片段329 bp。bax引物，上游：5′-GTTTCATCCAGGATCGAGC-3′；下游：5′-GGAAGTCCAATGTCCAGC-3′，扩增片段345 bp。β-actin引物，上游：5′-ATGTGGCACCACACCTTCTA-3′，下游：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3′，扩增片段838 bp。反应条件为：95 ℃预变性2 min，94 ℃45 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃复性5 min。经凝胶成像系统分析，分别计算survivin、bax与内参扩增带荧光强度×面积的比值，得出survivin、bax mRNA的相对表达量。经凝胶成像系统分析，通过survivin/β-actin和bax/β-actin的灰度比值作相对定量。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 各组胃癌BGC-823细胞增殖对比

不同浓度白毛藤随着作用时间延长，对细胞增殖反应抑制作用明显增强(P<0.01)；随着浓度增加，对细胞增殖抑制作用明显增强，各剂量组之间差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，白毛藤抑制胃癌细胞的增殖，呈浓度和时间依赖性,见表1。

3.2 荧光显微镜检测细胞凋亡情况

荧光显微镜观察不同浓度白毛藤作用48 h后，可见蓝色深染的凋亡细胞，并可见细胞核碎裂，细胞体积缩小。实验组与对照组比较有显著性差异，见图1、2。

表1 各组胃癌BGC-823细胞增殖对比

注：与4 mg·mL-1白毛藤组对比，**P<0.01

图1 对照组荧光显微镜细胞图

图2 16 mg·mL-1白毛藤水提液荧光显微镜细胞

3.3 各组survivin和bax基因表达情况

与对照组相比，不同浓度白毛藤水提液作用48 h后，肿瘤细胞中survivin基因表达逐渐降低，bax基因表达逐渐增加，16 mg·mL-1组最明显，见表2。

表2 各组bax和survivin表达情况

注：与对照组比较，**P<0.01，*P<0.05

4 讨论

胃癌是常见的消化道肿瘤之一，化学治疗在胃癌治疗中占有很重要的地位，但存在较严重的不良反应和耐药性。目前中药因其不仅对肿瘤具有抑制作用，且不易产生耐药性，对机体的损伤和副作用也较小，已经成为治疗肿瘤的重要手段。因此，从传统中药中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物研究及新药开发的重要组成部分。白毛藤作为抗癌中药之一，已证明有较强的肿瘤细胞增殖抑制活性，但对其抗癌作用机理阐述并不明确。

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡(Programed cell death，PCD)，是在精密调节下的细胞主动死亡过程，在个体发育生长过程中起重要作用。细胞凋亡的异常与多种病理生理过程相关，如肿瘤的发生发展、动脉粥样硬化、自身免疫疾病等。bcl基因家族是重要的凋亡调控基因，包括抑凋亡基因bcl-2、bcl-xl和促凋亡基因如bax、bak、bcl-xs等。现有研究发现[5-6]，bax在多种肿瘤的细胞凋亡调控中发挥重要作用。白毛藤水提液可以明显上调胃癌BGC-823细胞bax基因表达，随着药物浓度的增加，肿瘤细胞中bax基因表达逐步上调，与对照组比较，差异具有统计学意义。survivin作为凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成员，对细胞凋亡和细胞周期的基因调控具有重要的作用。大部分肿瘤细胞中均有表达[7-8]，是迄今发现最强的凋亡抑制因子。本研究结果证实，白毛藤水提液可以明显下调胃癌BGC-823细胞survivin基因表达，随着白毛藤水提液药物浓度的增加，肿瘤细胞中survivin基因表达逐步下调，与对照组比较，差异具有统计学意义。

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StudyofWaterExtractofWholeHerbofSolanumLyratumonInducingApoptosisofHumanGastricCancerBGC-823CellsandItsEffectiveMechanism

YANG Xu-dong1，ZHUANG jie1，XU Xiao-yu2

(1.MudanjiangMedicalCollege，Mudanjiang157011，China；2.SecondClinicalMedicalCollegeofHarbinMedicalUniversity，Harbin150076，China)

Objective: To investigate the effect of the bax and survivin gene in whole herb ofSolanumlyratumThunb.inducing apoptosis of human gastric cancer lines BGC-823 cell.Methods: BGC-823 cells were treated with water extract of whole herb ofS.lyratumat different concentrations， After 48h, the apoptosis of BGC-823 cell was observed by fluorescence microscope，and the levels of bax and survivin gene expression were detected by RT-PCR method.Results: The water extract of whole herb ofS.lyratumhas obviously apoptosis-inducing effects on BGC-823 cells and could effectively decrease the level of survivin gene expression and increase the level of bax gene expression.Conclusion: The water extract of whole herb ofS.lyratumcould induce apoptosis of BGC-823 cells probably through down regulating bax gene expression and u Pregulating survivin gene expression.

SolanumlyratumThunb.; Gastric cancer lines BGC-823 cell; Apoptosis

黑龙江省卫生厅科研课题——白毛藤抗肿瘤单体筛选及其对肿瘤细胞基因表达的影响(2007-003)

*杨旭东，Email：xingzhe01mdj@126.com

2010-11-12)