盐酸强力霉素分子印迹聚合物的制备及分子识别性能

丁彦庭,张成丽,周艳梅＊,窦俊超

(1.河南大学基础实验教学中心,河南开封 475004; 2.河南大学化学化工学院,河南开封 475004）

盐酸强力霉素分子印迹聚合物的制备及分子识别性能

丁彦庭1,张成丽2,周艳梅2＊,窦俊超2

(1.河南大学基础实验教学中心,河南开封 475004; 2.河南大学化学化工学院,河南开封 475004）

以盐酸强力霉素(DC)为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、四氢呋喃(THF)为溶剂,采用本体聚合法制备了DC的分子印迹聚合物.在水溶液中,采用平衡结合方法和Scatchard模型评价了该聚合物的结合特性及识别机理,并考察了DC分子印迹聚合物的选择性吸附能力.结果表明,在所研究的浓度范围内,DC分子印迹聚合物中形成两类不同的结合位点;高亲和力结合位点的离解常数和最大表观结合量分别为 Kd1=116.83μmol·L-1,Qmax1=68.98μmol·g-1;低亲和力结合位点的离解常数和最大表观结合量分别为 Kd2=12.75μmol·L-1,Qmax2=15.13μmol·g-1.与此同时,DC分子印迹聚合物对DC呈现出高的选择吸附特性.

盐酸强力霉素;分子印迹聚合物;制备;分子识别;应用

Abstract:Molecular imprinted polymers of doxycycline hydrochloride(DC)were synthesized viabulk polymerization route by using DC as the template molecule,methacrylic acid as the functional monomers,and ethylene dimethacrylate(EGDMA)as the crosslinker.Equilibrium binding experiments and Scatchard analysis were made to evaluate the binding characteristics and recognition mechanism of the DC molecular imprinted polymers in aqueous solution.Scatchard analysis showed that two classes of binding sites were produced in the polymer matrix within tested concentration range.The dissociation constant(Kd)and apparent maximum binding capacity(Qmax)for high affinity binding sites wereKd1=116.83μmol·L-1andQmax1=68.98μmol·g-1,and those for low affinity binding sites wereKd2=12.75μmol·L-1and Qmax2=15.13μmol·g-1.At the same time,the imprinted polymers possessed good selective adsorption capacity for DC.

Keywords:doxycycline hydrochloride;molecularly imprinted polymers;preparation;molecular recognition;application

分子印迹技术(MIT)是用于识别特定目标分子的技术,分子印迹聚合物(MIPs)[1-2]是首先由模板分子与可聚合的功能单体通过静电作用、范德华力、疏水作用和氢键等非共价键或共价键作用形成主客体配合物,加入引发剂和交联剂进行聚合反应,制得高分子聚合物,然后利用化学或物理方法除去模板分子,得到能“记忆”模板分子构型和功能基团的刚性聚合物,从而对模板分子表现出特异的识别能力.MIPs不但具有选择性高、稳定性好、应用范围广等优点,而且具有较强的分离和富集能力,已逐渐发展成为化学化工领域的一个研究热点,在催化、色谱分离[3]、过程监测和分析[4-6]、生物传感器[7]等领域均得到了快速发展.

盐酸强力霉素(DC)属于第二代四环素类抗生素,对溶血性链球菌、葡萄球菌等革兰氏阳性菌,多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌等革兰氏阴性菌均有较强的抑制作用,抗菌范围较广,被大量应用于畜牧、水产养殖,部分DC会残留在生物体内,由此可能导致食品中DC药物残留超标,从而对消费者造成危害.因此,建立快速、高选择性富集DC的方法,以便于DC的过程监测,对保障食品安全具有重要的科学意义.在过程监测中往往需要首先富集样品,而目前对于DC的富集还没有高选择性的方法.本文作者利用新型分子印迹技术,以DC为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体,首次合成了DC分子印迹聚合物,研究了其对DC的动力学吸附性能.采用平衡结合方法和Scatchard模型评价了该聚合物的结合特性及识别机理,考察了其选择性吸附能力.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

盐酸强力霉素(开封制药厂);α-甲基丙烯酸(MAA,天津市科密欧化学试剂开发中心,使用前减压蒸馏除去阻聚剂);乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA,ACROS试剂);偶氮二异丁腈 (AIBN,上海化学试剂公司,使用前重结晶);四氢呋喃(天津市大茂化学试剂厂).实验中所用水均为二次水、所用试剂均为分析纯.

LabTech-1000型紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司);SKY-100C型恒温培养振荡器(上海苏坤实业有限公司);KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).

1.2 分子印迹聚合物的制备

称取适量DC溶于20.0 mL THF中,超声5 min,待完全溶解后,加入适量的MAA,振荡6 h使DC与MAA充分作用,加入适量交联剂EGDMA和50 mg引发剂AIBN,于50 mL具塞比色管中,混合均匀,通氮气脱氧15 min后,密封,并将其放入60℃水浴中聚合反应24 h,所得浅黄色棒状聚合物经粉碎后过200目筛,使用V(甲醇)∶V(乙酸)=9∶1混合溶液洗至紫外分光光度计检测不出DC为止,最后用蒸馏水洗涤除去残留的乙酸和甲醇.得到的聚合物在恒温真空干燥箱中于60℃干燥24 h,即制得DC印迹聚合物(MIP).

非印迹聚合物 (NMIP)的制备,除不加DC外,其余步骤同MIP的制备.

1.3 MIP的静态结合实验

准确称取MIP或NMIP 40.0 mg放入10 mL试管中,加入5.0 mL已知浓度的DC水溶液,置于25℃恒温培养振荡器中,于室温下振荡8 h,用0.22μm的滤膜过滤,滤液用紫外分光光度法测定DC的平衡浓度,根据吸附前后溶液中DC的浓度变化,计算聚合物的吸附量Q,平行测定三次取平均值.吸附DC后的MIP按照制备过程洗脱模板的方法洗去DC后,可以重复利用.

2 结果与讨论

2.1 功能单体、交联剂用量对聚合物吸附效果的影响

改变功能单体、交联剂的用量,分别合成出不同比例下的MIP和NMIP,然后在相同条件下进行静态结合实验,结果如表1所示,表中M1、M2、M3、M4为印迹聚合物,N1、N2、N3、N4为对应的非印迹聚合物.

由表1可以看出,M2和N2、M3和N3、M4和N4这三组比例的聚合物,对DC的吸附量相近,而M1和N1对DC的吸附量差别较大,且其吸附量最大,对目标分子印迹效果较好.因此,以下表征所用的印迹聚合物和空白聚合物是M1和N1.

2.2 MIP对DC的结合动力学

为了考察MIP对DC的结合速率,在5 mL浓度为5×10-5mol·L-1的DC溶液中,加入同样量的MIP,分别在不同时间内测定MIP对DC的结合量,结果如图1所示.

从图1动力学曲线中可以看到,在前20 min内结合速率很快,而后趋向缓慢,1 h后结合量基本上达到平衡.MIP是具有立体孔穴结构的高分子聚合物,可能会有深孔和浅孔存在.开始阶段,由于是浅孔对模板分子结合,所以速率较快,浅层的孔穴饱和后,模板分子向深孔传质具有一定的位阻,以致结合速率下降[8].为保证MIP对DC充分结合,后续实验中控制吸附时间为60 min.

表1 功能单体、交联剂用量对MIP吸附量的影响Table 1 The influence of the amount of MAA and EGDMA to adsorption

2.3 MIP的结合等温线

利用静态结合实验,来考察MIP对DC的吸附特性.根据其对不同初始浓度DC水溶液的吸附量Q,绘制吸附等温线,如图2所示.

图1 MIP与DC的结合动力学曲线Fig.1 Curve of binding dynamics of MIP for DC

图2 MIP(a)和NMIP(b)与DC的结合等温线Fig.2 Binding isotherm of MIP(a)and NMIP(b)for DC

从图2可以看出,随着DC浓度的逐渐升高,MIP和NMIP对DC的吸附量都呈增大趋势,但在所考察的浓度范围内,MIP的吸附量明显大于NMIP,且随DC浓度的增大,二者吸附量的差别增大.说明NMIP

对DC的吸附主要是非特异性吸附,其吸附能力相对较弱;而 MIP包含有功能基固定排列的空穴,其大小和结构与模板分子相互补,这种空穴对印迹分子DC具有“记忆”功能,因而MIP对DC的吸附能力强.

2.4 MIP的Scatchard分析

图3 MIP的Scatchard曲线Fig.3 Scatchard plot of MIP

Scatchard模型被广泛用来评价分子印迹聚合物的结合特性及识别机理[9],Scatchard方程可以描述为:

式中,Kd是结合位点的平衡离解常数,Qmax是结合位点的最大表观结合量,cDC是DC在滤液中的平衡浓度.将静态结合实验所得数据按(1)式作图,可以得到Scatchard图,如图3所示.

由图3可见,在 Scatchard图中,Q/cDC与 Q是非线性关系,表明MIP的结合位点并不是等价的,但在图的两端呈两个明显的直线关系,这就说明了在所研究的DC浓度范围内,MIP存在两类不同的结合位点.由Scatchard图两端直线的斜率和截距可以求得,高亲合力的结合位点的离解常数为 Kd1=116.83μmol·L-1,最大表观结合常数为 Qmax1=68.98μmol·g-1;低亲合力结合位点的离解常数为 Kd2=12.75μmol·L-1,最大表观结合常数为 Qmax2=15.13μmol·g-1.

2.5 MIP对DC的选择性吸附

选择与DC的官能团和结构相似的土霉素进行结合试验,以判定MIP和NMIP对DC的选择性,类似物的结构式如图4所示,MIPs和NMIPs对DC和类似物的吸附量如表2所示.表2的 K为静态吸附分配系数.

式中cp表示底物在聚合物上的浓度(mg/g),cs表示底物在溶液中的浓度(mg/mL).

图4 土霉素、盐酸强力霉素的结构式Fig.4 Structures of oxytetracyline and doxycycline

表2 MIP及NMIP对不同物质的吸附性能Table 2 Adsorption properties of tested substrates on MIP and NMIP

由表2可以看出,一方面MIP对DC的结合量远高于其对土霉素的结合量;另一方面,NMIP对DC的结合量明显低于MIP,进而说明在MIP中模板分子的印迹效应发挥了重要作用,使得MIP对DC表现出高的选择性.

结论:以DC为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,合成了DC分子印迹聚合物.在水溶液中,利用静态平衡结合法和Scatchard分析法证实了此印迹聚合物对DC具有高的选择性吸附能力,可以将其用于固相萃取及液相色谱的固定相,为DC的过程监测提供了新的选择性富集材料.

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Synthesis of molecular imprinted polymers of doxycycline hydrochloride and their property in molecular recognition

DING Yan-ting1,ZHAN G Cheng-li2,ZHOU Yan-mei2＊,DOU Jun-chao2

(1.Basic Teaching Ex periment Center,Henan University,Kaif eng475004,Henan,China;
2.College of Chemistry and Chemical Engineering,Henan University,Kaif eng475004,Henan,China)

O 632.5

A

1008-1011(2011)01-0088-04

2010-09-03.

2008年度河南省政府决策研究招标课题(B153);河南省教育厅自然科学研究项目(2008B610001).

丁彦庭(1955-),女,高级实验师,研究方向为光谱分析.＊

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