大型溞母溞暴露于氨氮所产子代对氨氮毒性的耐受性

赵志刚，张志生，程 杰，陈传斌，高士祥

南京大学环境学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，江苏 南京 210046

大型溞母溞暴露于氨氮所产子代对氨氮毒性的耐受性

赵志刚，张志生，程 杰，陈传斌，高士祥*

南京大学环境学院，污染控制与资源化研究国家重点实验室，江苏 南京 210046

采用大型溞(Daphnia magna)作为受试生物，在测定了氨氮对大型溞的急慢性毒性效应的基础上，进一步研究了在慢性毒性试验中暴露于氨氮环境下的母溞所产子代对氨氮的毒性响应.急性毒性试验结果表明，氨氮对大型溞的24 h和48 h的LC50分别为165.97和69.54 mg/L.21 d慢性试验结果表明:大型溞的生长指标——脱皮数是对氨氮最为敏感的毒性参数;其慢性毒性下限值(LCL)和慢性毒性上限值(UCL)分别为1.88和3.75 mg/L;据此计算出的慢性毒性值(CHV)为2.66 mg/L，急慢性比(ACR)为26.14.在慢性试验中，暴露于毒物的母体所产的子代幼溞，与对照组相比，其48 hLC50都有所增大(增幅为13.7%～56.2%)，说明对毒物的适应性有所增强.

氨氮;大型溞;急性毒性;慢性毒性;子代

Abstract:The acute and chronic toxicity effects of ammonia nitrogen were studied usingDaphnia magnaas the test organism.The toxicity response of the offspring born by pregnant individuals during chronic exposure to ammonia nitrogen was further studied.The acute toxicity test showed that the 24 hLC50and 48 hLC50of ammonia nitrogen to this organism were 165.97 and 69.54 mg/L，respectively.The results of 21 d chronic toxicity testing showed that the number of exuviations，one of the grow th parameters，was the most sensitive indicator，from which the values of Lower Chronic Limit(LCL)and Upper Chronic Limit(UCL)were determined to be 1.88 and 3.75 mg/L，respectively.The Chronic Value(CHV)was calculated as 2.66 mg/L using theLCLandUCL.A ll the data allowed us to obtain the Acute-to-Chronic Ratio(ACR)as 26.14.In contrastwith the control，the 48 hLC50of ammonia nitrogen to the offspring born by the pregnant individual during the chronic test exposure were greater(increased by 13.7%-56.2%)，which suggested thatmaternal exposure to ammonia nitrogen could improve the adaptability of the offspring to the same chemical.

Keywords:ammonia nitrogen;Daphnia magna;acute toxicity;chronic toxicity;offspring

随着我国工农业的快速发展，氨氮已经成为全国性首要污染.2008年重点流域水污染考核结果显示，氨氮已超过化学需氧量(COD)成为影响地表水水环境质量的首要指标.水中氨氮主要来源于生活污水中含氮有机物受微生物作用的分解产物、工业废水以及农业面源.研究［1］表明，水中氨氮可降低鱼类、甲壳类和软体动物的能量代谢活动，损害其鳃、肝、肾、脾和甲状腺组织，并可降低动物体内血红蛋白输氧的能力，严重时可导致死亡.在溶液中总铵由处于平衡态的非离子氨(NH3)和离子铵)2种形式组成.二者比例主要取决于 pH和其他一些因素.非离子氨 NH3是非极性化合物，有较大的脂溶性，能穿透细胞膜毒害组织.因此，非离子氨的毒性比离子铵大得多［2］.

水溞是世界范围内广泛分布的枝角类无脊椎动物，已被广泛应用于污染物的毒性研究［3-7］.这主要是由于其对污染物非常敏感.大型溞(Daphnia magna)是一种重要的水溞代表种.目前对大型溞已有许多研究，但有关暴露于污染物中的母溞所产幼溞对污染物的耐受性还鲜见报道.笔者在研究了氨氮对大型溞急性和慢性毒性的基础上，对在慢性毒性试验中母溞所产幼溞的急性毒性进行了评价，以期为了解氨氮对水生态系统造成的生态风险和推导保护我国水生生物的氨氮水质基准值提供依据.

1 材料和方法

1.1 材料

大型溞为实验室内以斜生栅藻培养的同一母溞所产、培养3代以上的幼溞.

氯化铵(分析纯，含量＞99.5%)购于南京化学试剂厂.

仪器主要包括电子天平〔BS124S，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司〕，智能光照培养箱(LRH-250-Gb，广东韶关鑫腾科普仪器有限公司)，连续变倍体视显微镜(XTZ-E，上海立光精密仪器有限公司)，精密pH计〔PB-10，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司〕，溶氧仪(LIDA820，上海理达仪器厂)和电导率仪(CONscan30，上海理达仪器厂)等.

试验用水为活性炭过滤并充氧曝气48 h以上的自来水，试验前于培养箱中平衡2 h.平衡后水温为(22±1)℃，pH为7.9～8.0，ρ(溶解氧)＞5 mg/L，电导率为(285±20)μS/cm，总硬度为(118.5±4.2)mg/L(以CaCO3计).

1.2 大型溞急性毒性试验

取溞龄为6～24 h的新生幼溞，参照经济合作与发展组织(OECD)标准方法［8］进行试验.先将氯化铵用蒸馏水配制成高浓度母液，再用水稀释至设定浓度.先进行预试验以确定正式试验浓度设定范围.正式试验中按几何级数浓度系列设置6个浓度，每个浓度设4个平行，同时设空白对照.由于转移大型溞时会夹带部分水，配制某浓度溶液时均分为A和B 2份，先将大型溞移至A液再移至B液中进行试验，以尽可能减少水对溶液的稀释.每个容器中放5只幼溞(满足生物量≥2 m L/只)，每个浓度共20只.试验在光照培养箱中进行，培养条件为:光暗比 16 h∶8 h，光强为2 000 lx，(22±1)℃.试验期间不喂食，持续48 h.试验终点为死亡，即在体视镜下观察其心脏停止跳动.

1.3 大型溞慢性毒性试验

慢性毒性试验按照 OECD标准方法［9］进行.试验容器为9 cm培养皿，试液体积为50 m L，每个培养皿中随机放入1只溞龄小于24 h的新生健康幼溞，加盖以防止受试液挥发.根据急性毒性试验结果设置慢性毒性受试浓度组6组，每组6个平行.同时设一对照组.其中最高浓度组低于急性毒性LC50值.采用静态更新试液法，每隔一天更新一次受试液.并加入一滴绿藻浓缩液〔斜生栅藻(Scenedesmaceae obliquus)〕，使试液中藻细胞密度达50×104m L-1以上，以喂食大型溞.试验持续21 d，每天观察记录大型溞存活、脱壳、生长、怀孕和产仔情况.考察指标有:7 d体长，21 d体长，脱壳数，首次怀孕时间，首次产卵时间，首胎产卵量和每只母溞生殖期所产幼溞总数(平均值)等.

1.4 慢性子代急性毒性试验

在大型溞慢性毒性试验中，当母溞进入产卵高峰期时，搜集每个处理组怀孕母溞同一天所产且非第一代幼溞，用于测定氨氮对其的急性毒害.试验方法同1.2节，考察受试子代对氨氮暴露的适应性变化.

1.5 质量保证

为保证试验结果的有效性，同时测定重铬酸钾对大型溞的24 hEC50值，为0.7 mg/L，满足标准要求 (0.5～1.2 mg/L).整个试验过程中ρ(溶解氧)＞5 mg/L.对照组没有抑制现象.在试验过程中采用纳氏试剂分光光度法测定了受试液中氨氮实际含量，ρ()占设定浓度的85.0% ～109.3%，在 ±20%范围内，因此试验采用设定浓度而未加以修正.

1.6 数据处理与分析

所有处理组数据用单样本 K-S检验是否符合正态分布. 急性LC50值是根据 Trimmed Spearman-Karber统计分析方法，使用 Trimmed Spearman-Karber(TSK)Program Version1.5［10］计算.慢性数据使用统计分析软件 SPSS16.0 for Windows分析各种指标与对照组差异，以获得受试物对大型溞的慢性毒性下限值(LCL)和慢性毒性上限值(UCL).然后根据这2个值求其几何平均值得到受试物慢性毒性值(CHV)，并由此得到急慢性比(ACR).

2 结果与讨论

2.1 氨氮对大型溞的急性毒性效应

氨氮对大型溞的急性毒性试验结果见表 1.对照组在试验结束时未出现抑制现象，死亡率为0.由于氨氮对大型溞急性毒害范围较大，死亡率随时间变化很剧烈，24 h时150.00 mg/L浓度组死亡率只有15%，而到了48 h则全部死亡.因此分2组进行试验，以便分别测定24 h和48 hLC50.24 h和48 h的毒性效应结果经单样本K-S检验，均符合正态分布(P＞0.05).采用TSK程序计算氨氮对大型溞的24 hLC50为165.97 mg/L，而48 hLC50为69.54 mg/L.由此可知，随着暴露时间的延长，大型溞体质明显下降，对氨氮的耐受能力也大大减弱.推测原因是氨氮降低了大型溞的能量代谢活动，并使其呼吸困难，体内输氧能力减弱导致供氧不足而死亡.试验过程中观察到暴露于氨氮中的大型溞有大量脱皮，游动能力和频率随时间的持续而显著降低.高浓度组则静止，仅在摇动容器时有微弱摆动，暴露一定时间即死亡.在整个试验中，大型溞运动受抑制数(EC)与死亡数(LC)相差不大.

表1 氨氮对大型溞的急性毒性试验结果Table 1 The acute toxicity results of ammonia toD.magna

2.2 氨氮对大型溞的慢性毒性效应

氨氮对大型溞的慢性毒性试验中各毒性指标随氨氮浓度的变化见表2.在21 d慢性毒性试验期间，对照组及各处理组中均没有个体死亡.与对照组相比，各处理组首次怀孕时间和首次产卵时间均有所增大.这与 EBERT［11］报道的毒物会延迟大型溞种群开始繁殖时间的现象一致.但是可能由于试验所设浓度的局限性等原因，这种差异性并不显著(P＞0.05).随着暴露浓度的增加，首胎产卵量略微增加，后又有所下降，ρ()达30.00 mg/L时，首胎产卵量与对照组相比增加了46%.平均每只母溞总产卵量除了7.50和15.00 mg/L的浓度组与对照组相比有显著降低之外，其余各组均没有显著变化.对于该原因还需进一步研究探讨.每只母溞21 d的脱皮数与其他指标相比，是一个较好的指标.各浓度组与对照组相比均有所降低，ρ()达3.75 mg/L及以上者均有显著降低. 说明氨氮能抑制大型溞的脱皮. SMART［1］的研究表明，水中氨氮可降低水生生物的能量代谢活动，损害其各种器官组织.推测氨氮抑制大型溞脱皮的机理可能与此有关.

由表2可知，在考察浓度范围内，7 d体长、首次怀孕时间、首次产卵时间和21 d体长等4个指标与对照组在0.05显著性水平上相比没有显著差异;首胎产卵量、每只母溞总产卵量和脱皮数等3个指标则有显著性差异，说明是敏感指标，其中最敏感的指标是脱皮数.由首胎产卵量、每只母溞总产卵量和脱皮数3个指标得出慢性毒性下限值(LCL)和慢性毒性上限值(UCL)列于表3.

由脱皮数指标得出氨氮对大型溞的LCL和UCL分别为1.88和3.75 mg/L.取二者几何平均值即氨氮对大型溞的CHV为2.66 mg/L，该值与急性48 hLC50之比得到ACR为26.14.

大型溞慢性毒性试验一般进行21 d暴露，但是有研究［12-13］指出:在进行大型溞慢性毒性试验时，大型溞早期(7～8 d)体长变化对环境因子较敏感，并提出以其早期的体长为试验指标，可以缩短试验周期.GEIGER等［14］也指出，水溞出生后的7 d内，其生长受抑制可能是动物慢性试验的良好指标.因此，笔者选择7 d体长作为考察指标，以验证该结论.但是试验结果表明，7 d体长指标对于衡量氨氮对大型溞的毒害并不是敏感指标.因此，该指标的推广和应用还需慎重考虑.另外，一些研究［15-17］指出，生殖指标是大型溞最敏感的指标.笔者所选的3个敏感指标中前2个即是生殖指标，说明对于衡量氨氮的毒性，生殖指标确是较敏感的指标.但从慢性试验结果来看，脱皮数作为衡量大型溞生长情况的指标，对于考察氨氮的毒性却是最敏感的.这些现象充分说明了大型溞的各生物学指标不仅对同一种药剂的敏感性有所差别，对不同药剂的反应模式也有所不同［18］.

表2 氨氮对大型溞的慢性毒性数据Table 2 The chronic toxicity of ammonia toD.magna

表3 氨氮对大型溞的慢性毒性试验结果Table 3 The chronic toxicity results of ammonia toD.magna

根据急性毒性试验结果，氨氮对大型溞的48 hLC50为69.54 mg/L，按照化学物质对水生生物的急性毒性分级［19］，属于低毒.但是其慢性毒性下限值为1.88 mg/L.说明氨氮对水生生物的长期慢性毒害不容忽视.

2.3 氨氮对慢性受试母溞所产子代的急性毒性效应

氨氮对慢性试验中受试母溞所产子代的急性毒性效应结果见图1.

在慢性试验中，暴露于毒物的母体所产的子代幼溞，与对照组相比，其 48 hLC50都有所增大(增幅为13.7%～56.2%).暴露于30.00 mg/L浓度组的母溞所产幼溞的 48 hLC50增至 108.62 mg/L，为对照组的156.2%.说明出生于毒物暴露环境中的幼溞，对毒物的适应性都有增强，且在受试浓度范围内有上升的趋势，ρ()为30.00 mg/L组的耐受性最强.EBERT［11］报道，毒物会延迟大型溞种群开始繁殖的时间，但是，当外界环境中污染物消失时，因受毒物影响延迟繁殖的母溞所生后代将会存活得更长并生长得更快.这说明大型溞对暴露毒物已经产生了相当的适应性. MUNZINGER等［20］也曾研究了镍对大型溞7代的影响，发现长期在毒物中生存的大型溞由于产生了适应性，其内禀增长率有所增加.对于可能在生物体内积累的毒物，还需要进一步研究毒物是否从母代遗传到子代，并且找到这种现象的原因，探讨母代受污染后所产生的子代在生理学及能力方面的变化等问题也将具有重要的生物学意义.

图1 慢性试验中暴露于各处理组母溞所产子代48 h LC50值Fig.1 The 48 hLC50ofD.magnaoffspring born in each concentration of the chronic test

3 结论

a.氨氮对大型溞的 24 hLC50为 165.97 mg/L，48 hLC50为69.54 mg/L.按照化学物质对水生生物的急性毒性分级标准，属于低毒.

b.在氨氮暴露环境中，大型溞的首胎产卵量、每只母溞总产卵量和脱皮数3个指标为敏感指标.由此得到氨氮对大型溞的LCL和UCL分别为1.88和 3.75 mg/L，CHV为 2.66 mg/L，ACR为26.14.氨氮对大型溞的长期慢性毒害不容忽视.

c.在慢性毒性试验中，暴露于氨氮的母溞所产的子代幼溞对氨氮的适应性都有增强，且在受试浓度范围内有增大趋势.

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Acute Toxicity o f Amm onia to O ffsp ring o f Daphnia m agna Born by Pregnant Individua ls During Chronic Exposure

ZHAO Zhi-gang，ZHANG Zhi-sheng，CHENG Jie，CHEN Chuan-bin，GAO Shi-xiang
State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse，School of the Environment，Nanjing University，Nanjing 210046，China

X171.5

A

1001-6929(2011)02-0205-05

2010-06-19

2010-11-05

国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX08526-003);国家高技术研究发展计划(863)项目(2007AA06A405)

赵 志 刚 (1987 -)， 男， 山 东 临 沂 人，xiaogang540@126.com.

*责任作者，高士祥(1962-)，男，江苏扬州人，教授，博士，博导，主要从事污染生态化学研究，ecsxg@nju.edu.cn