益气养血 利湿通络方对氟中毒大鼠抗氧化作用的研究

申惠鹏，喻茂娟，王 丹

（1.遵义医药高等专科学校，贵州 遵义 563002；2.贵阳医学院，贵州 贵阳 550004）

氟是一种化学性质活泼的非金属元素，氟除惰性气体外，能与所有元素结合，氟化合物广泛存在于空气、土壤、水源、动植物体内，人过量摄氟会引起机体内自由基和脂质过氧化物增多，但氟致机体自由基升高的机理并不十分清楚。氟是负性极强的元素，它本身不可能与体内氧形成自由基。但氟可刺激多形核白细胞（PMN）发生呼吸爆发，消耗氧气，释放超氧阴离子自由基（·O2-）和一氧化氮（NO）[1]。已有研究证实，采用电子自旋共振（ESR）法检测氟中毒大鼠肾脏自由基含量，发现染氟组自由基含量明显高于正常对照组和抗氧化中药组[2]。从治疗上来说，对氟中毒的治疗原则强调增强机体新陈代谢，促进氟化物的排泄[3]。

中医学认为，氟中毒为外界环境湿（毒）气侵及机体，伤及肝气肾精，致肝肾亏虚，使筋骨受损，经络阻滞，血行不畅；日久气滞血瘀，筋骨失养，筋脉痹阻不畅而发生关节屈伸不利、行走困难[4]。本研究本着中医扶正祛邪、除痹治标、祛氟治本、标本兼治的原则[5]，从贵州丰富的中药材中选取黄芪、当归、海风藤、金钱草等组成益气养血、利湿通络中药复方剂，拟通过动物实验筛选出能治疗亚慢性氟中毒的中药，并通过其对抗氧化指标的影响研究药效机制。在我国以辨证论治为指导，施以补气和血、强筋健骨、疏经通络为主治疗慢性氟中毒的基础上，探索理想的中药复方剂。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验试剂 氟化钠（NaF）（分析纯，由成都市联合化工试剂研究所生产）、蛋白测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒、谷胧甘肤过氧化物酶（GSH-Px）测试盒、过氧化氢酶（CAT）测试盒、总抗氧化能力（T-AOC）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒（由南京建成生物工程研究所生产）。

1.1.2 实验药物 中药复方剂的主要成分有黄芪、当归、海风藤、金钱草等（由遵义医药高等专科学校提供）。

1.1.3 药物制作 将各味药材按处方的40倍称取，尽量混匀，加水浸泡30分钟，煎煮2次。第1次15倍用水量，煎煮1.5小时，沸腾前温度调至105℃，沸腾后保持90℃，过滤；药渣第2次8倍用水量，煎煮45分钟，过滤，合并2次滤液。将合并滤液于水浴上蒸发浓缩，再置一般烘箱进一步浓缩和干燥处理后，粉碎处理成细粉状，密封保存，备用。

1.2 实验方法

1.2.1 染毒剂量及分组 本实验采用大鼠自由食用NaF 饲料的途径染毒。染毒剂量设计依据查阅的参考文献实验结果，并参考亚慢性染毒实验要求：通常取受试物LD50 的1/20～1/5 为最高剂量。参考文献中，NaF 对雄性大鼠经口染毒的LD50 为250 mg/kg，最后确定本次实验高氟组染氟剂量为100 mg/kg，中氟组染氟剂量为50 mg/kg。高氟营养不良组染氟剂量为100 mg/kg，且饲料中蛋白含量及钙含量减半，即每千克饲料中加入NaF110.5 mg，氟含量为50 mg/kg；每千克饲料中加入NaF221.1mg，氟含量为100 mg/kg。

染毒前适应性喂养一周（动物室相对湿度50%～60%）后，分层随机将442只大鼠分为4组，正常对照组16只，中氟组、高氟组、高氟营养不良组各142只，分别食用不同氟含量的食物，自由饮用自来水，每周观察大鼠生长发育状况及牙齿变化情况，每组分别于180天、210天、240天时随机抽取8只大鼠收集其24小时尿液，并在180天染毒结束时根据样本量大小，正常对照组处死8只，其余每组处死16只。

染毒180天后开始中药治疗，中药复方剂22.6 g 中药干粉相当于每人每天1 剂复方的用量。根据《医用实验动物学》动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表查得，人与大鼠折算系数（W）为6.25，人标准体重为70 kg，依照公式：大鼠用药剂量（mg/kg）=W ×人用药剂量（mg/kg），求得中药复方剂大鼠每天剂量为194 mg/100 g。中药干粉用蒸馏水配制成混悬液，每天1 ml/100 g经口灌服，每周灌服6天，连续灌服90天后处死。

中药治疗阶段动物分组及数量为对照组8只；中氟组、高氟组、高氟营养不良组每组再分为1个阳性对照组（18只）和中药复方治疗组（36只）灌服中药，其中再分为正常饲料组18只和持续染氟组18只，分组情况见图1。

图1 中药治疗阶段大鼠分组

1.2.2 实验方法 尿氟含量测定采用氟离子选择电极法，骨氟含量测定采用高温灰化-氟离子选择电极法，蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法，SOD 活性测定采用亚硝酸盐法，GSH-Px 活力测定采用二硫代双硝基苯甲酸（DTNB）直接法，T-AOC 水平测定采用比色法。CAT 含量测定采用比色法，MDA 含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）荧光法。

1.2.3 统计学处理 应用SPSS11.5 统计软件对实验数据进行整理汇总，计量资料行Levene 方差齐性检验、单因素方差分析。方差齐采用LSD 或SNK 法进行两两比较，方差不齐采用校正后的方差分析后行TamhaneT2 或DunnettT3 法进行两两比较。用Microsoft Excel 2003 软件绘制统计图。

2 结果

2.1 尿样及骨样中氟含量测定（见表1）

染毒阶段，各实验组尿氟含量均高于正常对照组，且高氟组及高氟营养不良组与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各实验组骨氟含量均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗阶段，各阳性对照组尿氟、骨氟含量均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且240天尿氟含量高于210天尿氟含量。

治疗组中的尿氟含量：中氟中药复方剂组正常饲料组尿氟含量低于中氟组，差异有统计学意义（P＜0.05）。中药复方剂组、正常饲料组在240天时尿氟含量也低于高氟组，差异有统计学意义；高氟营养不良中药复方剂组的正常饲料组尿氟含量均低于高氟营养不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

治疗组中的骨氟含量：中氟中药复方剂组正常饲料组骨氟含量低于中氟组阳性对照组，高氟组中药复方剂组低于高氟组，高氟营养不良组中中药复方剂组骨氟含量低于高氟营养不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示复方剂组有一定的排氟作用。

表1 实验大鼠尿氟和骨氟含量测定结果（ ±s）

表1 实验大鼠尿氟和骨氟含量测定结果（ ±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与中氟组比较，bP＜0.05；与高氟组比较，cP＜0.05；与高氟营养不良组比较，dP＜0.05

分组尿氟（mg/L） 骨氟（mg/kg）180天 210天 240天 180天 270天1.14 ±0.297.56 ±2.42a 2.70 ±0.76b 10.65 ±4.1519.43 ±6.32a 3.59 ±1.87c 12.97 ±6.6934.32 ±9.50a 3.80 ±1.33d 14.49 ±6.18d正常对照组中氟组中氟中药复方剂组高氟组高氟中药复方剂组高氟营养不良组高氟营养不良中药复方剂组阳性对照组正常饲料组持续染氟组阳性对照组正常饲料组持续染氟组阳性对照组正常饲料组持续染氟组1.24 ±0.372.53 ±0.6716.87 ±2.52188.39 ±46.43a 14.05 ±4.10198.16 ±26.94a 16.71 ±6.870.96 ±0.116.79 ±2.11a 2.63 ±1.31b 9.99 ±4.8310.88 ±3.34a 19.08 ±32.4311.84 ±16.1127.42 ±12.60a 3.30 ±0.26d 18.53 ±10.79261.05 ±90.62a 68.54 ±3.84223.95 ±21.54a 144.63 ±29.94b 185.91 ±54.86701.67 ±178.16a 312.54 ±31.48c 391.42 ±109.93c 794.66 ±261.35a 379.02 ±71.88d 492.18 ±49.31

表2 实验大鼠肝脏抗氧化指标测定结果（±s）

表2 实验大鼠肝脏抗氧化指标测定结果（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与中氟组比较，bP＜0.05；与高氟组比较，cP＜0.05；与高氟营养不良组比较，dP＜0.05

分组 总 SOD 活力（U/ml） GSH-Px（U/ml） CAT（U/gHb） T-AOC（U/ml） MDA（nmol/ml）15.46 ±2.3116.62 ±3.0824.33 ±5.4522.48 ±8.5125.99 ±2.98a 18.15 ±4.01c 14.52 ±1.17c 27.10 ±3.49a 14.73 ±3.31d 18.15 ±5.82d正常对照组中氟组中氟中药复方剂组高氟组高氟中药复方剂组高氟营养不良组高氟营养不良中药复方剂组阳性对照组正常饲料组持续染氟组阳性对照组正常饲料组持续染氟组阳性对照组正常饲料组持续染氟组132.49 ±1.6891.50 ±2.28a 113.76 ±13.80b 113.55 ±0.54b 102.41 ±12.34a 122.70 ±13.66c 129.24 ±0.62c 90.57 ±7.11a 105.33 ±24.07d 117.15 ±1.16d 444.02 ±32.95258.15 ±87.00a 348.95 ±24.90b 209.66 ±97.28186.49 ±99.56a 236.67 ±16.37289.35 ±41.83c 140.39 ±18.60a 155.05 ±65.08265.08 ±77.91d 45.22 ±5.9982.85 ±17.70a 94.66 ±21.1992.90 ±17.3994.30 ±11.36a 93.25 ±8.5591.87 ±16.7687.30 ±14.12a 90.19 ±11.7698.15 ±21.01254.46 ±14.21149.43 ±19.87a 301.19 ±132.41380.56 ±38.58b 127.48 ±15.26a 446.22 ±133.02154.24 ±19.73108.22 ±2.54a 114.24 ±7.72352.37 ±123.08d

表3 实验大鼠肾脏抗氧化指标测定结果（±s）

表3 实验大鼠肾脏抗氧化指标测定结果（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与中氟组比较，bP＜0.05；与高氟组比较，cP＜0.05；与高氟营养不良组比较，dP＜0.05

分组 总 SOD 活力（U/ml） GSH-Px（U/ml） CAT（U/gHb） T-AOC（U/ml） MDA（nmol/ml）48.72 ±11.7078.61 ±3.96a 106.96 ±26.2484.63 ±2.04b 111.40 ±37.51a 146.89 ±50.60162.13 ±32.32111.59 ±10.15a 82.08 ±5.96119.83 ±10.90正常对照组中氟组中氟中药复方剂组高氟组高氟中药复方剂组高氟营养不良组高氟营养不良中药复方剂组阳性对照组正常饲料组持续染氟组阳性对照组正常饲料组持续染氟组阳性对照组正常饲料组持续染氟组103.52 ±0.1776.27 ±7.86a 84.96 ±18.4474.90 ±13.6179.45 ±8.58a 130.49 ±13.42c 103.84 ±16.18c 106.17 ±18.4266.95 ±15.3797.46 ±3.45128.16 ±26.9692.89 ±9.98a 97.58 ±61.9090.19 ±45.7581.76 ±24.27a 170.23 ±59.03c 137.07 ±21.70c 72.36 ±12.35a 98.05 ±16.47d 96.31 ±36.2842.11 ±14.8350.79 ±21.1763.82 ±32.01135.06 ±103.5193.80 ±5.98a 130.80 ±53.6372.57 ±32.84106.85 ±11.41a 55.52 ±15.74d 83.84 ±24.37157.64 ±38.62136.02 ±20.66173.94 ±66.40113.14 ±19.10117.32 ±17.27a 209.13 ±18.17c 149.33 ±32.5896.96 ±34.71a 86.18 ±4.15139.73 ±8.19d

2.2 肝脏抗氧化指标测定（见表2）

SOD 活性，所有阳性对照组均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药复方剂组正常饲料组和持续染氟组SOD活性均高于中氟组；高氟中药复方剂正常饲料组和持续染氟组高于高氟组；高氟营养不良中药复方剂组的正常饲料组和持续染氟组的SOD 活性高于高氟营养不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

GSH-Px 活性，所有阳性对照组均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中氟中药复方剂组正常饲料组GSH-Px活性介于中氟组和正常对照组之间，且高于中氟组；高氟中药复方剂组持续染氟组GSH-Px 活性介于高氟组和正常对照组之间，且高于高氟组；高氟营养不良中药复方剂组持续染氟组GSH-Px 活性介于高氟组和正常对照组之间，且高于高氟组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

CAT 含量，所有阳性对照组均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。中药复方剂组对降低CAT 活性无明显作用。

T-AOC 水平，所有阳性对照组均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高氟中药复方剂组持续染氟组高于高氟营养不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

MDA 含量，高氟组、高氟营养不良组高于正常对照组，有统计学意义（P＜0.05）；高氟中药复方剂组的正常饲料组肝脏MDA含量介于高氟组和正常对照组之间，且低于高氟组，有统计学意义，高氟中药复方剂组持续染氟组MDA 含量低于高氟组；高氟营养不良中药复方剂组正常饲料组和持续染氟组MDA 含量低于高氟营养不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 肾脏抗氧化指标测定（见表3）

SOD 活性，中氟组、高氟组SOD 活性低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高氟中药复方剂组的正常饲料组和持续染氟组SOD 活性高于高氟组，且正常饲料组SOD 活性高于持续染氟组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

GSH-Px 活性，所有阳性对照组均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高氟中药复方剂组持续染氟组和正常饲料组GSH-Px 活性高于高氟组；高氟营养不良中药复方剂组的正常饲料组GSH-PX活性高于高氟组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

CAT 含量，高氟组、高氟营养不良组高于正常对照组，有统计学意义（P＜0.05）；高氟营养不良中药复方剂组的正常饲料组CAT 低于高氟营养不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

T-AOC 水平，高氟组、高氟营养不良组低于正常对照组，有统计学意义（P＜0.05）；高氟中药复方剂组的正常饲料组总抗氧化能力高于高氟组；高氟营养不良组中药复方剂组的持续染氟组高于高氟营养不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

MDA 含量，所有阳性对照组均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高氟营养不良中药复方剂组的正常饲料组MDA 含量低于高氟营养不良组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

目前，发现抗氧化作用的单味中药有：黄芪、银杏、淫羊藿、海风藤、红景天、芸香豆、枸杞、五味子、甘草、当归、赤芍、川芎、人参、蛤蚧、生姜、大枣等；中药复方制剂有归脾汤、六味地黄丸、逍遥散、人参汤、复方何首乌片、益气活血方、复方丹参汤等[6，7]。研究发现，这些药物中大多含有酯类、生物碱类、酮类、鞣质类等抗氧化成分，可清除羟自由基、氧自由基、H2O2、单线态氧等活性氧，它们对氧化损伤导致的多种疾病有很好的治疗效果。

尿氟和骨氟含量会随染氟时间增长而升高，经过中药复方剂的治疗，中药复方剂组尿氟、骨氟含量较各自的阳性对照组低，说明中药复方剂可减少氟在机体内的蓄积。

本研究提示，中药复方剂可有效提高肝脏和肾脏抗氧化能力。中药复方剂的主要成分黄芪、当归中含有丰富的抗氧化成分和微量元素，不仅可直接增强抗氧化力，还为金属酶提供了辅酶，使其活性提高，对抗自由基。目前亦有研究发现，多种抗氧化类中药中微量元素丰富，其中Fe 元素含量较高[8]。

评判抗氧化力的重要指标有SOD 和GSH-Px，其中SOD 是广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，可平衡机体内的氧自由基。所以，当机体发生氟中毒时，自由基水平的增高势必会大量消耗SOD，使之活性降低。另外，依据金属辅基的不同成分可将SOD分为3类，第一类含铜和锌，称为铜锌超氧化物歧化酶，主要存在于真核细胞和细胞浆中；第二类含锰，称为锰超氧化物歧化酶，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中；第三类含铁，称为铁超氧化物歧化酶，只存在于原核细胞中[9]。因此，机体内金属微量元素的减少或失衡会造成SOD 活性降低。

GSH-Px 是机体内广泛存在的重要的过氧化物分解酶。机体中的自由基或过氧化氢可将GSH-Px 中的硒醇离子氧化成硒次磺酸衍生物和羟基化合物，然后由GSH 供氢，与硒次磺酸衍生物作用后产生酶-底物复合物和水，酶-底物复合物再与GSH 反应，生成原来的GSH-Px 与氧化型谷胱甘肽（GSSG），从而将自由基或H2O2还原成羟基化合物和H2O，同时氧化型GSSG 再由谷胱甘肽还原酶（GR）还原为GSH[10]，所以GR 活力的降低，GSSG 还原为GSH 的能力下降，会使GSH 含量减少[11]，作为供氢体的GSH 的减少势必引起GSH-Px 活性的下降。

染氟后，AOS 的增加可直接消耗SOD 和GSH-Px 而使其含量下降。中药复方剂有一定降低CAT 活性的能力，并有清除MDA 的效果。CAT 和MDA 都是脂质过氧化过程中的中间产物，其中MDA可交联蛋白质和磷脂的氨基，影响膜流动性，使膜脆性增加，其含量的变化可间接反映组织中氧自由基含量的变化。所以中药复方剂提高抗氧化力的同时还可减少脂质过氧化物含量。

抗氧化指标和脂质过氧化指标均显示，大鼠食用高氟饲料6个月后中药灌胃，即食高氟饲料的同时实施中药治疗，亦可改善抗氧化指标，显示中药复方剂对机体长期处于高氟环境，体内氟积累达较高程度时，仍具有抗氧化能力；在正常饲料组中也有明显效果，说明脱离高氟条件时应用中药仍可加速体内氟的排出。但是由于氟对肝、肾造成不可逆的损害，所以持续染氟组和正常饲料组之间的差异无统计学意义。

综上所述，益气养血、利湿通络中药复方剂能提高肝、肾抗氧化酶SOD、GSH-Px 的活性，亦能提高T-AOC 水平，同时还可降低MDA 含量。

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