多黏菌素B联合不同抗菌药物抗耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的协同作用

颜秉兴，孟英红，孙迎军，李建军

濮阳市油田总医院检验科濮阳457001

(2010-12-16收稿 责任编辑 徐春燕)

碳青霉烯类药物因抗菌谱广、稳定性强、能抵御最常见的产β-内酰胺酶菌，已成为治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最后手段。在临床治疗中缺乏一种非常有效的药物抵御碳青霉烯类多重耐药菌株，两种或多种抗菌药物联合应用有望产生协同效应。多黏菌素B(PB)、强力霉素(DOX)及利福平(RIF)等已单独和(或)联合应用于治疗多重耐药菌株［1］。作者采用棋盘微量稀释法观察了PB与几种抗菌药物联合抵御耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的协同作用。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与保存 2004年1月至2010年10月濮阳市油田总医院保存的16株碳青霉烯类耐药菌，其中肺炎克雷伯菌11株，大肠埃希菌5株，均来自不同患者。使用Vitek 2 Compact和API 20E条鉴定菌株。菌株于脑心浸液肉汤中－80℃保存，试验前在含体积分数5%的绵羊血平板上转种2次。

1.2 培养基、抗菌药物和质控菌 培养基:MH琼脂和MH肉汤为法国生物梅里埃公司产品。抗菌药物:PB、RIF、DOX、头孢吡肟 (FEP)、头孢曲松(CRO)、庆大霉素(GM)购自北京生物制品检定所，亚胺培南(IMP)为默沙东公司产品。质控菌:大肠埃希菌ATCC25922。

1.3 部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)的计算

1.3.1 初筛 利用 Vitek 2 Compact对耐 IMP菌株进行筛选，初筛阳性菌株进一步检测该菌对包括IMP在内的各种药物的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。

1.3.2 棋盘微量稀释法测定MIC及抗菌药物联合试验 ①用96孔U型微量板(棋盘)分别测定拟联合的抗菌药物对检测菌的MIC值。②根据测定的MIC值确定药物的稀释度，最高浓度为2×MIC。两种药物的稀释分别在棋盘的纵列和横列进行，即沿横轴稀释的药物在纵列上各孔的药物浓度相同，反之亦然。每个孔A药和B药各50μL，接种菌液100μL，最终药物浓度为孔内所加浓度的1/4，细菌接种量为5×105CFU/mL。35℃孵育24 h，肉眼观察孔内有无细菌生长。FICI=A药联合时的MIC/A药单测时的MIC+B药联合时的MIC/B药单测时的 MIC，判断标准［2］:FICI＜0.5 为协同，0.5 ～4 为无关，＞4为拮抗。

1.3.3 药敏判断标准 对于PB，作者参考铜绿假单胞菌和不动杆菌属的折点，把MIC≤2 mg/L定为敏感。利福平参考文献［3］，其余均参考2010年CLSI文件［4］。

2 结果

2.1 不同来源菌株的MIC值 大多数菌株来自于痰和尿标本，除PB、RIF和DOX外，试验菌株对其他抗菌药物均耐药，见表1。

表1 测试菌对试验药物的MIC值 mg/L

2.2 药物联合试验结果 对于所有试验菌株，PB与RIF或DOX在生理浓度下均存在协同效应，联合后PB的MIC值降低3倍以上。只有1株菌PB与GM在一种联合浓度发生协同效应，见图1上。PB与FEP、IMP、CRO无明显的协同效应，也未发现拮抗现象，图1中、下为代表菌株的FICI分布图。

图1 代表菌株的FICI分布上:7号菌;中:1号菌;下:15号菌;黑色方框表示 FICI＞0.5，灰色方框表示有菌生长，白色方框表示无菌生长且FICI＜0.5。

3 讨论

虽然PB从20世纪60年代应用于临床并有良好的疗效，但它的药代动力学和药效学尚未阐明［5］。目前，CLSI有关PB抵御肠杆菌科菌株的敏感性试验尚无判断标准。根据作者的经验，PB在该地区对多重耐药铜绿假单胞菌和不动杆菌属敏感性相对较高，故选择PB作为该研究的基础。

该研究结果显示，除PB、RIF和 DOX外，试验菌株对其他抗菌药物均耐药。对于所有试验菌株，PB与RIF或DOX在生理浓度下均存在协同效应，联合后PB的MIC值降低3倍以上。除1株菌PB与GM联合出现范围较窄的协同效应外，PB与其他试验药物未出现协同效应，也未出现拮抗现象。Bratu等［6］研究RIF与PB联合抵御肺炎克雷伯菌时发现，16株菌中15株出现协同;IMP与PB联合，10株出现协同，3株拮抗。作者的研究结果显示RIF与PB联合结果与Bratu等的结果基本相同，IMP与PB联合结果差异很大，但与Elemam等［7］的报道相似。Wareham等［8］通过联合用药试验研究多重耐药鲍曼不动杆菌时发现，协同作用不具有普遍性，还可能存在菌株依赖性，因此各地区的结果会有差异，临床医生应以当地的试验结果为依据。

综上所述，PB与RIF、DOX体外联合抵御耐碳青霉烯大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌存在协同作用。因为体内体外的结果并非完全一致，还需要临床医生和微生物学者共同努力，进一步完善此类研究。

致谢 药剂科李东副主任药师给予技术指导。

［1］ Taccone FS，Rodriguez-Villalobos H，De Backer D.Successful treatment of septic shock due to pan-resistant Acinetobacter baumannii using combined antimicrobial therapy including tigecycline［J］.Eur JClin Microbiol Infect Dis，2006，25(4):257

［2］ Elemam A，Rahimian J，Mandell W.Infection with panresistant Klebsiella pneumoniae:a report of 2 cases and a brief review of the literature［J］.Clin Infect Dis，2007，49(2):271

［3］叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.3版.南京:东南大学出版社，2006.

［4］ Clinical and Laboratory Standards Institute/NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:20th ed.CLSI/NCCLSM100-S20［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2010，Wayne，Pa.

［5］ Zavascki AP，Goldani LZ，Li J，et al.Polymyxin B for the treatment of multidrug-resistant pathogens:a critical review［J］.J Antimicrob Chemother，2007，60(6):1206

［6］ Bratu S，Tolaney P，Karumudi U，et al.Carbapenemaseproducing Klebsiella pneumoniae in Brooklyn，NY:molecular epidemiology and in vitro activity of polymyxin B and other agents［J］.J Antimicrob Chemother，2005，56(1):128

［7］ Elemam A，Rahimian J，Doymaz M，et al.In vitro evaluation of antibiotic synergy for polymyxin B-resistant carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae［J］.J Clin Microbiol，2010，48(10):3558

［8］Wareham DW，Bean DC.In vitro activity of polymyxin B in combination with imipenem，rifampicin and azithromycin versus multidrug resistant strains of Acinetobacter baumannii producing OXA-23 carbapenemases［J］.Ann Clin Microbiol Antimicrob，2006，5:10