Siltuximab单克隆抗体对荷耐紫杉醇卵巢癌细胞株裸鼠肿瘤生长的影响*

郭玉琪，田 捧，路 平，赵潇丹，DUANZhenfeng，张 展#

1)郑州大学第三附属医院妇产科郑州450052 2)哈佛大学麻省总医院肉瘤实验室波士顿MA02114

(2010-12-13收稿 责任编辑 姜春霞)

卵巢癌是严重危害妇女健康的三大癌症之一，在我国其发生率居第3位，但病死率居妇科恶性肿瘤的首位。目前临床对其治疗仍以手术为主，同时配合放化疗进行综合治疗。但多药耐药的形成限制了化疗药物的效果，是化疗失败的一个主要原因［1］。研究［2-3］发现，白细胞介素-6(IL-6)以及 IL-6激活Stat3与多药耐药的形成有关。在卵巢癌患者的血清和腹水中IL-6高水平存在，而且也发现IL-6产物在卵巢癌耐药细胞株中增加［3-5］。对于卵巢癌来说，尽管IL-6作为一个肿瘤标志物较CA125缺少敏感性，但其产生可能与肿瘤的侵袭和预后有关［3，5-6］。此外，研究［7］也表明，针对调节 IL-6 通路的治疗策略可能直接影响细胞对顺铂和阿霉素耐药。作者前期的研究［8-9］显示:Siltuximab体外可有效阻断IL-6的信号传导通路和IL-6介导的基因表达。为了进一步确定IL-6的信号传导通路的阻断对卵巢癌治疗的意义，作者首先建立分泌高水平IL-6的耐药卵巢癌细胞株的小鼠移植瘤模型，然后评估抗IL-6单克隆抗体Siltuximab对异种移植肿瘤的生长的影响，为探索治疗卵巢癌的新策略提供了依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和药物 RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素均购自美国Life Technologies公司(Grand Island，NY)。基质胶由BD Biosciences公司提供。支原体检测试剂盒购自美国Cambrex公司(Rockland，ME)。抗IL-6单克隆抗体Siltuximab和非特异性抗体F105由Centocor公司生产。紫杉醇由美国哈佛大学麻省总医院提供。

1.2 细胞株和细胞培养 人卵巢癌细胞株SKOV-3购自美国菌种保藏中心(Rockville，MD)。在美国哈佛大学麻省总医院肉瘤实验室建系的紫杉醇耐药卵巢癌细胞株SKOV-3TR的获得参考文献［10］。所有的细胞被培养在RPMI 1640培养基中，其中含有体积分数10%胎牛血清、0.1 U/L青霉素和0.1 mg/L链霉素。细胞培养在37℃、体积分数5%CO2的培养箱中，每2～3 d传代一次。紫杉醇耐药细胞株定期培养在含有200 mmol/L紫杉醇的培养基中以确认其多药耐药性。用支原体检测试剂盒定期检测，以保持细胞没有支原体污染。

1.3 实验动物 该动物实验方案经美国哈佛大学麻省总医院动物管理委员会批准，批准号2004 N000296/1。选用 3～4周的 Crl:SHO-PrkdcSCIDHrhr雌性裸小鼠，购自 Charles River实验室(Ann Arbor，MI)。

1.4 移植瘤小鼠模型的建立 选用3～4周的雌性裸小鼠36只，制备体内异种移植瘤小鼠模型。在基质胶中加入5×106mL－1的浓缩SKOV-3TR细胞悬液，然后取0.1 mL注入小鼠的背侧面，所有动物的注射都需要有基质胶的存在。

1.5 Siltuximab对肿瘤生长的影响 2周后，小鼠被分成6组。第1组(A组):用生理盐水腹腔注射;第2组(B组):用非特异性抗体F105(20 mg/kg)腹腔注射;第3组(C组):用Siltuximab(20 mg/kg)腹腔注射;第4组(D组):用紫杉醇(20 mg/kg)腹腔注射;第5组(E组):用紫杉醇(20 mg/kg)和Siltuximab(20 mg/kg)混合腹腔注射;第6组(F组):用紫杉醇(20 mg/kg)和非特异性抗体F105(20 mg/kg)腹腔注射。紫杉醇(20 mg/kg)和Siltuximab(20 mg/kg)的剂量依据文献［11-12］。以上6组小鼠，每周治疗2次，持续5周。每天检查小鼠健康状况和肿瘤生长情况。用电子数字卡尺(游标卡尺)每周测量2次肿瘤的大小，计算肿瘤体积。

1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0进行统计学处理，采用重复测量数据的方差分析比较各处理因素作用后不同时间点裸鼠移植肿瘤体积有无差异，检验水准 α =0.05。

2 结果

各组裸鼠移植肿瘤体积的比较见表1。

表1 各组裸鼠移植肿瘤体积的比较 mm3

3 讨论

IL-6是一种多功能的抗肿瘤凋亡因子，是一种潜在的、临床上非常重要的抗凋亡基因表达和耐药的调节因子，阻断IL-6和其下游的Stat3的促炎和抗凋亡的影响已经成为卵巢癌治疗中一个非常重要的努力方向。作者长期关注IL-6在药物耐药中的作用，已经建立了许多紫杉醇耐药细胞株，这些细胞株大多数高水平表达IL-6。此外，美国哈佛大学麻省总医院肉瘤实验室已经建立了一个特殊的荧光Stat3细胞，以监测肿瘤细胞系中IL-6介导的Stat3的激活。最近对卵巢癌耐药细胞株的研究表明:Siltuximab能够抑制IL-6介导的Stat3的磷酸化和核转移，可显著降低Stat3下游蛋白(如MCL-1、Bcl-XL和 Survivin)的表达水平［9-10］。研究［10］表明，经过IL-6处理的SKOV-3细胞株中许多基因的表达水平发生了改变，而Siltuximab处理后，许多IL-6介导的基因的表达减弱。此外，Siltuximab还增加了紫杉醇在体外紫杉醇耐药卵巢癌细胞株中的细胞毒作用。这些结果表明Siltuximab有效阻断了IL-6的信号通路和IL-6介导的基因表达。

为了进一步确定IL-6的信号传导通路的阻断对卵巢癌治疗的意义，作者首先建立了分泌高水平IL-6的耐紫杉醇卵巢癌细胞株的小鼠移植瘤模型，评估抗IL-6单克隆抗体Siltuximab对异种移植肿瘤生长的影响，结果显示:Siltuximab对裸鼠体内卵巢癌耐药细胞SKOV-3TR移植瘤的生长无明显影响。

动物实验阴性的原因，一种可能是在该研究中使用的紫杉醇耐药细胞株SKOV-3TR较敏感SKOV-3细胞株耐受100倍的紫杉醇，而治疗剂量(20 mg/kg)的选择是依据敏感的细胞株SKOV-3［12］。这种剂量(20 mg/kg)可能在抑制肿瘤生长时药量不足。而增加紫杉醇的剂量也是不可能的，因为小鼠对紫杉醇的耐受是有限的。另一种可能性是Siltuximab抗体剂量(20 mg/kg)的选择是基于文献数据，这可能不是体内抗耐药细胞的最佳剂量。最后，Siltuximab抗体可能没有渗透到肿瘤的有效部位。在对药物抵抗卵巢癌的Siltuximab/紫杉醇联合治疗的临床开发中，这些可能性应优先考虑。

Siltuximab对体内肿瘤生长的影响及与紫杉醇的协同作用需要进一步的研究，为通过阻断IL-6介导的信号传导通路，探索治疗卵巢癌的新策略提供更多的依据。

［1］ Yusuf RZ，Duan Z，Lamendola DE，et al.Paclitaxel resist-ance:molecular mechanisms and pharmacologic manipulation［J］.Curr Cancer Drug Targets，2003，3(1):1

［2］ Duan Z，Foster R，Bell DA，et al.Signal transducers and activators of transcription 3 pathway activation in drug-resistant ovarian cancer［J］.Clin Cancer Res，2006，12(17):5055

［3］ Penson RT，Kronish K，Duan Z，et al.Cytokines IL-1beta，IL-2，IL-6，IL-8，MCP-1，GM-CSF and TNFalpha in patients with epithelial ovarian cancer and their relationship to treatment with paclitaxel［J］.Int J Gynecol Cancer，2000，10(1):33

［4］ Scambia G，Testa U，Benedetti PP，et al.Prognostic significance of interleukin 6 serum levels in patients with ovarian cancer［J］.Br J Cancer，1995，71(2):354

［5］ Liu J，Yang G，Thompson-Lanza JA，et al.A genetically defined model for human ovarian cancer［J］.Cancer Res，2004，64(5):1655

［6］王秋兰，张俊会.宫颈癌中HPV16感染与IL-6表达的关系［J］.肿瘤防治研究，2010，37(1):77

［7］ Pu YS，Hour TC，Chuang SE，et al.Interleukin-6 is responsible for drug resistance and anti-apoptotic effects in prostatic cancer cells［J］.Prostate，2004，60(2):120

［8］ Voorhees PM，Chen Q，Small GW，et al.Targeted inhibition of interleukin-6 with CNTO 328 sensitizes pre-clinical models of multiple myeloma to dexamethasone-mediated cell death［J］.Br J Haematol，2009，145(4):481

［9］郭玉琪，路平，Duan Z，等.siltuximab单克隆抗体对卵巢上皮性癌中白细胞介素6/Stat3信号传导通路的影响［J］.中华妇产科杂志，2010，45(11):854

［10］Guo YQ，Nemeth J，O’Brien C，et al.Effects of Siltuximab on the IL-6-induced signaling pathway in ovarian cancer［J］.Clin Carcer Res，2010，16(23):5759

［11］Steiner H，Cavarretta IT，Moser PL，et al.Regulation of growth of prostate cancer cells selected in the presence of interleukin-6 by the anti-interleukin-6 antibody CNTO 328［J］.Prostate，2006，66(16):1744

［12］Hu L，Hofmann J，Lu Y，et al.Inhibition of phosphatidylinositol 3＇-kinase increases efficacy of paclitaxel in in vitro and in vivo ovarian cancer models［J］.Cancer Res，2002，62(4):1087