仙茅提取物对小鼠成骨细胞增殖的影响＊

吴国清，伍旭明，赵光树，马成坚

(1.浙江省立同德医院，浙江 杭州 310012; 2.浙江省中医院，浙江 杭州 310006;3.浙江大学医学院附属第一医院，浙江 杭州 310009)

仙茅是石蒜科多年生草本植物仙茅 Curculigo orchioides的根茎，是补肾助阳的传统中药，能补肾阳、强筋骨、祛寒湿，在治疗“骨瘘”“骨痹”“腰背痛”“虚损”等中医证候时常用其加减配伍，但其确切药理机制还不明晰。笔者以小鼠成骨细胞MC3T3－E1为细胞模型进行体外试验，观察仙茅醇提液对成骨细胞增殖的影响。

1 仪器与试药

CO2细胞培养箱(美国Forma Scientific);倒置相差显微镜(日本Olympus，);全自动酶标读数仪(日本DYNEX公司)。仙茅药材购自浙江省杭州市华东医药有限公司药材参茸分公司。MC3T3－E1细胞由浙江大学传染病研究所保存。3－(4，5－二甲基－2－噻唑)－2，5－二苯基溴化四氮唑盐(MTT，粉剂，美国Sigma公司)用磷酸盐缓冲液配成质量浓度为5 g/L的溶液，过滤除菌，4℃避光保存，2周内有效。细胞培养基为DMEM培养基(美国GIBCO公司);0.25%胰酶消化液(美国GIBCO公司)，－20℃保存备用;PAA胎牛血清(上海微科生物有限公司)，－20℃保存备用。

2 方法与结果

2.1 药物制备

将仙茅粉碎过20目筛，称取100 g，以75%乙醇水浴回流提取3次(1 h/次)，回收乙醇，配成大约相当于生药材1 g/mL的储备液，0.45 μm微膜过滤、除菌，4℃保存备用。试验时用无血清DMEM培养基依次稀释成终浓度为 1 ∶250，1 ∶500，1 ∶1 000，1∶1 500的溶液。

2.2 MC3T3－E1细胞的培养和增殖检测

将成骨样细胞MC3T3－E1接种于培养瓶中，置37℃、饱和湿度、CO2分压为5%的细胞培养箱中进行培养传代。选取传至第3代、生长旺盛的MC3T3－E1成骨样细胞，用4%胎牛血清成骨样细胞培养基配制成5×104个/mL成骨样细胞悬液，接种于96孔成骨样细胞培养板，贴壁生长24 h后，移除血清，加入不同梯度浓度的仙茅提取物，每个浓度4个复孔。于37℃和5%CO2培养箱48 h后，每孔加入30 μL MTT溶液(2 g/L)，继续培养4 h，吸净上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，振荡5～15 min，使MTT还原产物结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪测定每孔光密度值(OD值)，波长为570 nm。以含有等体积的未加仙茅提取物的细胞孔测得的吸光度值为对照，将不同浓度的加药组与对照组之间进行均值比较，所得数据均经ANOVA检验。细胞增殖率=(实验组－对照组)/对照组×100%。

2.3 结果

仙茅提取物和MC3T3－E1细胞共孵育48 h后，低浓度(1∶1 500)对细胞增殖没有影响，中浓度(1∶1 000)对细胞增殖影响明显，随着药物浓度的增加，对MC3T3－E1细胞增殖的影响也明显加大。结果见表1和图1。

表1 仙茅提取物对MC3T3－E1细胞增殖的影响(A值，±s，n=4)

表1 仙茅提取物对MC3T3－E1细胞增殖的影响(A值，±s，n=4)

注:与对照组比较，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

药物浓度1∶1 500 1∶1 000 1∶500 1∶250加药组0.83 ± 0.05 0.95 ± 0.06△1.11 ± 0.15△1.33 ± 0.05▲对照组0.73 ± 0.10增殖率(%)6.0 21.7 51.9 66.3

3 讨论

图1 与仙茅提取物共孵育后MC3T3－E1细胞生长曲线(λ=570 nm)

中医理论认为，肾与骨的关系非常密切。《素问宣明五气论》说:“五脏所主，肾主骨。”《素问·应象大论》说:“肾生骨髓，肾精充足，则骨髓生化有源，骨得髓的充分滋养而坚固有力。”根据“肾主骨”理论，补肾阳、强筋骨的仙茅常配伍加减用于“骨瘘”“骨痹”“腰背痛”“虚损”等症，且取得一定效果[1－2]。在骨折修复和骨质疏松症的发生发展中，成骨细胞扮演着关键角色。MC3T3－E1细胞株是1981年Sudo H和Kodama HA等[3]从新生C57BL/6小鼠颅盖骨中分离培养建株的成骨细胞株，该细胞株具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性，包括碱性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型胶原合成和基质钙化等特性，常作为骨代谢研究的细胞模型。

本研究结果表明，仙茅提取物能明显促进MC3T3－E1成骨细胞的增殖，且增殖影响大小与其浓度有密切关系。因此加速成骨细胞的增殖与分化，增强成骨细胞活性，使骨量增加，促进骨修复和骨形成，可能是仙茅能用于骨质疏松症治疗的部分机制，这也与很多抗骨质疏松的“补肾”中药研究报道相符[4－7]。

仙茅中含有皂苷类、酚类、木脂素类、黄酮类、桉烷类、甜味蛋白和多糖类成分[8]，仙茅苷是其最主要的活性成分。本研究采用的是仙茅粗提物，具体是哪一个活性单体对MC3T3－E1细胞具有增殖活性，其是否影响成骨细胞的碱性磷酸酶、血管内皮生长因子等的表达等确切内在机制，尚需在后续实验中进一步探讨。

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