吲哚乙酸对微拟球藻生长和脂肪酸含量的影响

焦媛媛,俞建中,潘克厚

(中国海洋大学应用微藻生物学研究室,山东青岛266003)

吲哚乙酸对微拟球藻生长和脂肪酸含量的影响

焦媛媛,俞建中,潘克厚＊＊

(中国海洋大学应用微藻生物学研究室,山东青岛266003)

研究不同浓度吲哚乙酸(Indole-3-Acetic Acid,IAA)对微拟球藻(N annochloropsis oculata)生长和脂肪酸组成的影响。结果表明:在0.1 mg/L时,低于0.5 mg/L时IAA促进微拟球藻生长,但不影响叶绿素和不饱和脂肪酸合成; IAA促进生长作用最显著,最大比生长率为2.33 d-1。随浓度进一步增加,IAA促生长作用越来越小,并抑制叶绿素和不饱和脂肪酸合成;在5 mg/L时,IAA极显著抑制EPA合成。添加适当浓度IAA可促进藻细胞生长,缩短其生长周期。

吲哚乙酸;微拟球藻;比生长率;光密度法;叶绿素;脂肪酸

微拟球藻(N annochloropsis oculata)是1种重要的海洋经济微藻,属真眼点藻纲。该藻藻体微小,含有丰富的二十碳五烯酸(Eicasapentaenoic acid,EPA, 20:5ω-3),但不含有二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid DHA,22:6ω-3)[1],已被作为优良饵料大量应用于水产养殖[2]。另外,它还含有丰富的蛋白质、多种维生素和矿物质,具有很高的营养价值和保健功能,可作为人类食品添加剂和保健药物[3]。

植物激素对植物生长发育起着非常重要的调节作用。藻类和植物有很多相似之处,已经有一些植物激素和生长类似物在海洋藻类中被发现[4],也有关于植物激素对微藻生长影响的报道[5-7]。已有研究证实IAA对某些微藻生长有一定的促进作用[7-8],但IAA对细胞内化学物质尤其是脂肪酸组成及含量的影响,研究较少,目前有报道IAA可以提高淡水微藻TH6 (Oedocladiumsp.)的总脂肪酸含量[9],对海洋微藻的影响未见报道。

通过分析不同浓度IAA对细胞生长和细胞内叶绿素、脂肪酸组成的影响,本研究拟找出IAA促微拟球藻生长适合浓度,为大规模培养微拟球藻提供指导。

1 材料和方法

1.1 材料

微拟球藻(N.oculata),购自澳大利亚联邦科学与工业研究组织(CSIRO,Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation),编号为CS-179。

1.2 培养基及培养条件

用过滤煮沸的天然海水配制f/2培养基。培养条件:温度23℃;光照60～80μmol·m-2·s-1,光周期为12 h∶12 h。

1.3 实验方法

准确称取100 mg IAA(Sigma),溶于1 mL无水乙醇,加入双蒸水,配成1 mg/mL储存液。在350 mL培养基中接入起始接种密度20万个细胞/mL的藻细胞。设置5个IAA浓度0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L,不添加IAA为对照。三角瓶随机放置,每个浓度设置3个平行样。

1.4 生长指标的测定

1.4.1 比生长率测定 比生长率是衡量生物量增长快慢的参数,适用于比较微藻细胞指数生长期的生长速度。采用血球计数板计数法[10],在接种后第5天,微拟球藻进入指数生长期,取适量藻液,加鲁哥氏碘液进行固定,在显微镜下计数,每个处理取样3次计数取其平均值,连续计数5 d,直至细胞进入指数生长末期,比较比生长率的大小。比生长率(μ)的计算公式如下: μ=(lnNt-lnNo)/t其中No表示初始藻密度,Nt表示t天后藻密度,t表示培养时间。

1.4.2 光密度测定 不同浓度的藻液与细胞密度呈线性关系[11],本实验利用全波长酶标仪,在400～660 nm,每隔10 nm进行波长扫描,绘制吸收曲线,确定最大吸收峰波长[11],得出微拟球藻的最适波长为440 nm,本实验初始接种密度较低,所以在接种后的第3天,用酶标仪测定不同处理藻细胞培养液吸光值变化,连续测定10 d。

1.4.3 叶绿素荧光强度测定 藻类活体细胞叶绿素荧光强度与其含量呈线性关系[12],流式细胞仪测定的FL4(675 nm)参数直接反应单个细胞叶绿素的含量[13]。在接种后的第5天,微拟球藻进入指数生长期,测定不同处理组叶绿素的含量。用f/2培养基稀释5倍,保证细胞密度低于100万个细胞/mL,以对照组为阴性对照,测定荧光强度的变化。

1.5 脂肪酸组成分析和含量测定

当细胞进入指数生长末期,离心收集藻体,冷冻干燥。在Lepage和Toy的方法[14]上进行改进,准确称取20 mg干燥藻粉放入螺口试管中,加入1 mL 2 mol/ L KOH-CH3OH溶液,于75℃水浴中皂化10 min,冷却至室温,加入1.5 mL 3 mol/L HCl-CH3OH溶液, 75℃水浴甲酯化10 min,冷却至室温,加入2 mL正己烷和少量的蒸馏水促进分层,充分振荡,离心取上层正己烷分析脂肪酸组成。

脂肪酸组成分析采用美国Agilent 6890 series GC system气相色谱仪、氢火焰离子化检测器和HP-5毛细管柱(30 m×320μm×0.25μm,5%Phenyl Siloxane),根据待测峰与标样峰面积比和标样量计算各脂肪酸成分占总长链脂肪酸的百分含量。进样后程序升温:170℃恒温1 min,然后以3℃/min的升温速率升到210℃,保持25 min。进样口温度为210℃。载气为高纯氮,流速45 mL/min,氢气流速40 mL/min,空气流速450 mL/min,分流比1∶20,进样量1μL。

2 结果

2.1 IAA对微拟球藻生长的影响

在添加不同IAA浓度(对照、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mg/L)的培养基中培养12 d,从第5天开始显微计数,计算比生长率。由图1可见,当IAA浓度低于0.1 mg/L,最大比生长率均出现在计数的第7天,且0.05和0.1 mg/L IAA 2个处理组最大比生长率都高于对照组,分别为0.58和0.62,说明低浓度的IAA会刺激藻细胞加速生长。IAA浓度升高,比生长率低于对照组,出现了生长抑制现象。5 mg/L IAA的比生长率一直低于0,生长受到了严重的抑制。说明高浓度的IAA会抑制藻细胞生长。随着实验的进行,处理组和对照组比生长率差异减小,由于IAA浓度降低,并且微拟球藻进入指数生长末期。通过其光密度的变化,如图2所示,当IAA的添加量为0.1 mg/L时,光密度达到最大值,5 mg/L的IAA严重抑制了微拟球藻的生长,与比生长率得到的生长趋势一致。随着培养天数的增加,其光密度差异变小,与比生长率的逐渐变小相一致,微拟球藻细胞微小,显微镜计数造成的人为误差较大,光密度的测定可以反映微拟球藻的细胞密度变化,可操作性强,准确性高。对其最终密度进行单因素方差分析,由图3可见,当IAA的添加量为0.1～5 mg/L与处理组差异显著,当IAA的浓度为0.1 mg/L时,最终密度达到最大值为4 848万/mL,当IAA的浓度为5 mg/L时,严重抑制了微拟球藻的生长,最终密度为872万/mL。

图1 微拟球藻在不同浓度IAA条件下的比生长率Fig.1 Specific growth rate ofN annochloropsis oculata at different IAA concentrations

图2 不同浓度IAA对微拟球藻光密度的影响Fig.2 Influence of IAA concentration on the optical density ofN annochloropsis oculata

图3 微拟球藻在不同浓度IAA条件下的最终密度Fig.3 The final density ofN annochloropsis oculata at different IAA concentrations

通过流式细胞仪测定处于指数生长期的微拟球藻单个细胞内叶绿素荧光强度,如图4所示,通过单因素方差分析0.1和5 mg/L 2个处理组与对照组有差异, 0.1 mg/L IAA处理组微拟球藻细胞中叶绿素荧光强度明显低于对照组,这种现象的解释需要结合细胞密度分析,IAA使藻细胞处于分裂旺盛状态,数量明显增加,但是叶绿素的合成速度低于细胞分裂速度,使单个细胞内的叶绿素含量减少。5 mg/L IAA严重抑制了藻细胞的生长,叶绿素的合成受到影响,单个细胞叶绿素荧光强度明显低于其余各组。

图4 指数生长期微拟球藻在不同浓度IAA条件下的叶绿素荧光强度Fig.4 The Chlorophyll fluorescence intensity of N annochloropsis oculataat the exponential growth phase at different IAA concentrations

2.2 不同浓度IAA对微拟球藻脂肪酸组成的影响

添加不同量的IAA对脂肪酸组成的影响见表1。与对照相比,当IAA的浓度在0.1 mg/L时,14∶0、16∶0、16∶1在总脂肪酸中的比例有所提高,而20∶4、20∶5的比例有所降低,采用Duncan多重比较法,其差异显著。添加此浓度生长素细胞分裂活动活跃,藻细胞生长迅速,促进了细胞内饱和脂肪酸的合成,抑制了不饱和脂肪酸尤其是EPA的合成。当浓度为0.05和0.5 mg/L时,对脂肪酸进行多重比较,结果显示与对照组之间、相互之间不存在显著差异,这说明对生长影响不显著的IAA浓度同样对脂肪酸合成无明显作用。随着IAA浓度的升高,使微拟球藻的生长和叶绿素含量受到严重影响,光合作用下降,影响了细胞内脂类物质的合成,使不饱和脂肪酸的合成大大受到影响。当浓度为1和5 mg/L时,EPA在总脂肪酸总的比例下降,与对照组差异显著。

表1 不同浓度的IAA对微拟球藻脂肪酸组成的影响Table 1 Influence of IAA concentration on the fatty acid composition ofN annochloropsis oculata

3 讨论

生长素是第一个被发现的植物激素[15],已有研究证明生长素大部分是由吲哚类化合物组成,其中吲哚乙酸IAA是含量最高的1种生长素,不仅能够在高等植物体内合成,也可以在藻类细胞中合成[16],已发现藻类存在T1R1生长素受体[17],当IAA作用于细胞时,首先与受体结合,促进RNA和蛋白质的生物合成,为细胞分裂提供物质基础,促进性状的产生[15]。在高等植物中,植物激素参与调节植物体内的生理过程.如强化植物对营养物质的吸收[18]。在海洋藻类中,已有研究证明IAA可以促进大型海藻孔石莼的生长和分裂[19],本实验通过比生长率、最终藻细胞浓度和光密度比较发现,当IAA的添加量为0.1 mg/L时,明显促进微拟球藻生长,但高浓度IAA却抑制微拟球藻生长,这个现象也同样存在于高等植物中[20],IAA对微拟球藻叶绿素的合成无明显促进作用,过高浓度的IAA抑制了藻细胞内叶绿素的合成,所以,选择适当的IAA浓度才能促进微拟球藻的生长。

关于微拟球藻长链不饱和脂肪酸的生物合成途径已有一些报道,从18∶2开始以n-3和n-6 2条途径合成多不饱和脂肪酸[21]。已有报道生长抑制剂可以提高微拟球藻中EPA的含量[21],本实验得出IAA对不饱和脂肪酸的合成无明显促进作用。高浓度IAA严重抑制了EPA的合成,目前没有关于植物激素对脂肪酸合成途径中所起具体作用的相关文献报道。文中设想高浓度IAA抑制微拟球藻的生长,叶绿素含量降低影响光合作用效率,细胞内物质的生物合成受到限制,使不饱和脂肪酸的底物或合成过程中酶的含量降低,从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。但需要更深入研究才能阐明真实机理。

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Abatract: The effects of IAA(indole-3-acetic acid,IAA)on the growth and fatty acid composition of N annochloropsis oculatawere investigated.When the concentration was lower than 0.5 mg/L,IAA promoted the growth ofN.oculataand did not affect the synthesis of chlorophyll and unsaturated fatty acids.The most significant promotion to the growth was observed when IAA was 0.1 mg/L.The fastest cell specific growth rate was 2.33 d-1.When the concentration was higher than 0.1 mg/L,IAA gradually attenuated its promotion to the growth ofN.oculataand performed its inhibition of the biosynthesis of chlorophyll and unsaturated fatty acids with the increase of concentration.When the concentration was 0.5 mg/L,IAA most significantly inhibited the synthesis of eicosapentaenoic acid(EPA),making the percentage of EPA the lowest among the analyzed.Addition of IAA at an appropriate concentration promotes the growth of microalgal cells and shortens their growth cycle.

Key words: Indole-3-acetic acid(IAA);N annochloropsis oculata;specific growth rate;optical density; chlorophyll;fatty acid

责任编辑 于 卫

Effects of Indole-3-acetic Acid on the Growth and Fatty Acid Composition of Nannochloropsis oculata

J IAO Yuan-Yuan,YU Jian-Zhong,PAN Ke-Hou
(Lab of Applied Microalgae Biology,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Q948.8;Q949.9

A

1672-5174(2011)04-057-04

国家科技支撑计划项目(2006BAD09A12)资助

2009-10-13;

2009-11-09

焦媛媛(1985-),女,硕士,主要从事微藻生态研究。E-mail:lemon198566@yahoo.com.cn

E-mail:khpan@ouc.edu.cn