饲料中添加还原型谷胱甘肽对牙鲆生长和抗氧化能力的影响

王芳倩,张文兵,麦康森,徐玮,王小洁,刘付志国

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛266003)

饲料中添加还原型谷胱甘肽对牙鲆生长和抗氧化能力的影响

王芳倩,张文兵＊＊,麦康森,徐玮,王小洁,刘付志国

(中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室,山东青岛266003)

以酪蛋白、明胶为主要蛋白源配制精制基础饲料,添加不同浓度梯度的还原型谷胱甘肽(GSH),饲料中GSH的含量分别为0、97.96、189.92、371.84、688.72和1 063.56 mg·kg-1,在流水式养殖系统中分别投喂初始体质量为(9.49± 0.22)g的牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼,8周后观测各组牙鲆的生长情况及机体的抗氧化状态。结果表明,饲料中添加外源的GSH对牙鲆成活率没有显著影响(P>0.05);牙鲆增重率(WGR)在饲料GSH含量为371.84 mg·kg-1时达到最大值,显著高于其它各组(P<0.05);饲料GSH添加组牙鲆肝脏中GSH的含量显著高于零添加组(P<0.05);各处理组肝脏中丙二醛(MDA)的含量没有显著差异(P>0.05);肝脏中谷胱甘肽还原酶(GR)的活力随饲料中GSH含量的升高呈现先降低后上升的趋势,并在饲料中GSH含量为371.84 mg·kg-1时达到最低值;肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活力没有受到饲料中GSH含量的显著影响(P>0.05);饲料中GSH含量为371.84 mg·kg-1时,肝脏中总抗氧化力(T-AOC)显著高于1 063.56 mg·kg-1组(P<0.05),谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活力显著低于其它各组(P<0.05)。根据WGR的实验数据,利用折线模型得到牙鲆幼鱼饲料中GSH的适宜含量为368.92 mg·kg-1,过高或过低都会对生长造成负面影响,抑制机体抗氧化能力,增加机体氧化压力。

牙鲆;饲料;谷胱甘肽;生长;抗氧化

还原型谷胱甘肽(GSH)是由γ-谷氨酰环化转移酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶催化细胞内谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸脱水而成的含有巯基的天然三肽,体内主要由肝脏合成,与氧化型谷胱甘肽(GSSG)相互转化,以维持细胞正常的生理过程[1-2]。哺乳动物中的研究发现,外源型GSH可以被小肠直接吸收进入血液循环[3-4],食物中补充GSH在机体内可以起到清除自由基、缓解缺血性再灌注损伤[5]、防止脂质过氧化[6]等多种生理功能。另外,GSH作为Ⅱ相解毒酶——谷胱甘肽S-转移酶(GST)的作用底物,参与机体的解毒作用,能够与毒素结合形成1种新的可溶性物质,使毒素的毒性大大降低[7]。

水生动物体内GSH水平对外界条件的变化很敏感[8-9],体内的GSH在鱼体解除重金属毒性[10],免受多氯联苯的氧化损伤[11],提高抵抗微囊藻毒素毒性的能力[12]等方面起到了重要的作用;同时,影响草鱼[13]和凡纳滨对虾[14]的生长和抗氧化能力。目前,关于水产饲料中应用GSH的研究主要集中于淡水鱼和虾类。凡纳滨对虾饲料中添加GSH可以提高体内过氧化物酶活性[14]、提高肝胰腺抗氧化能力和降低脂质过氧化水平[15]、提高GSH在体内的蓄积[16-17]。草鱼饲料中添加GSH可以提高特定生长率、成活率、饲料转化率和血清中IGF-1的水平[13],同时提高肝脏和肌肉中GSH的沉积和抗氧化能力[18]。饲料中添加100～400 mg·kg-1的GSH,能够显著增强罗非鱼的摄食和生长,提高总抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力[19]。然而,GSH通过食物途径对海水养殖鱼类的生长、生理代谢和饲料利用等方面的影响,还没有相关的报道。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水养殖品种之一,然而由于爱德华氏菌症、淋巴囊肿病等顽固性疾病的日益严重,养殖成活率下降,给牙鲆养殖业造成极大的损失[20]。目前,牙鲆的基本营养需求已经明确,那么怎样通过营养途径来提升养殖牙鲆的健康水平,提高牙鲆的产量和品质,已经成为人们日益关注的焦点。本研究拟利用以酪蛋白和明胶为蛋白源配制的精制饲料,分析在饲料中添加不同浓度梯度的GSH对牙鲆生长和抗氧化能力影响,为GSH在牙鲆饲料中的应用提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 实验饲料

以酪蛋白、明胶为主要蛋白源,鱼油为主要脂肪源,糊精为主要糖源配制等氮等能的精制饲料,基础饲料配方和营养组成见表1。在基础饲料中添加不同梯度的GSH,分别为:0、100、200、400、700和1100 mg·kg-1;饲料中GSH含量的实测值分别为:0、97.96、189.92、371.84、688.72和1 063.56 mg·kg-1。

制作饲料时,先将各种饲料原料粉碎,过60目筛,逐级扩大混合均匀后,先后加入油和水,用双螺杆挤条机(华南理工大学,F-26(Ⅱ)型)加工成型,37℃烘干,制成颗粒饲料,-20℃储存备用。

表1 实验基础饲料配方及营养组成Table 1 Ingredients and composition of the basal diet

1.2 饲养与管理

牙鲆幼鱼购自山东省日照市良种示范基地,为当年孵化的同一批鱼苗,初质量为(9.49±0.22)g,实验鱼个体无病无伤,体质健壮。饲养实验在中国海洋大学鳌山卫实验基地流水养殖系统中进行,每个水槽为1个养殖单位,容积为300 L,水流速度为1 L·min-1,水温(17～25)℃,盐度30±1,溶氧不低于6 mg·L-1, p H=7.6～8.3。

正式实验开始前,先用基础饲料驯化2周,待牙鲆完全适应精制饲料和养殖环境后,开始随机分组进行实验。实验共6个处理,每个处理设置3个重复,每个重复放鱼30尾。养殖实验持续8周,实验期间自然光照,每天投喂2次(08··00和18··00)。

1.3 样品采集

实验结束前,牙鲆禁食24 h后称质量和计数。每个重复(水槽)随机取8尾牙鲆,解剖采集肝脏,液氮速冻后-80℃冻存备用。

牙鲆的生长情况用增重率(WGR)来表示,其计算公式如下:

式中,Wt-终体质量(g);Wi-初始体质量(g)

1.4 样品测定

将肝脏组织解冻,取采集到的8尾鱼肝脏在预冷的匀浆介质(mg/μL=1/9)中匀浆混合均匀,4℃下3 500 r/min离心15 min,取上清,进行指标测定。

组织匀浆液的总蛋白测定使用南京建成生物工程研究所蛋白试剂盒,以考马斯亮蓝染色;GSH、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的测定采用南京建成生物工程研究所试剂盒,利用二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物的反应比色测定;丙二醛(MDA)使用南京建成生物工程研究所试剂盒,根据硫代巴比妥酸法进行比色定量测定;GST使用南京建成生物工程研究所试剂盒,利用GST催化GSH与1-氯-2,4-二硝基苯的结合能力的原理比色测定;SOD使用黄嘌呤氧化酶法测定,使用南京建成生物工程研究所试剂盒;T-AOC采用酶标仪进行比色定量测定,使用南京建成生物工程研究所试剂盒。

1.5 数据统计分析

所有数据均采用SPSS软件进行统计分析。每个处理得到的数据用单因素方差分析(ANOVA)。当不同处理之间有显著差异(P<0.05)时,用Tukey检验比较不同处理间的平均值。实验结果用平均数±标准差(±S.D.)表示。

2 实验结果

2.1 GSH对牙鲆增重率和成活率的影响

如表2所示,饲料中添加不同剂量的GSH对牙鲆幼鱼的成活率没有显著影响(P>0.05),成活率在97.58%～100.00%范围内变动。

GSH含量为371.84 mg·kg-1饲料组牙鲆的增重率在所有处理组中显著最高(P<0.05),其值为118.81%±10.06%,其他各组间的增重率没有显著差异(P>0.05)。通过折线模型拟合,得知当饲料中GSH含量为368.92 mg·kg-1时,牙鲆增重率达到最大值116.34%(见图1)。

表2 饲料中还原型谷胱甘肽(GSH)的不同水平对牙鲆增重率(WGR)和成活的影响(平均值±标准差,n=31)Table 2 Effects of dietary reduced glutathione(GSH)on the weight gain rate(WGR)and survival of Paralichthys olivaceus(Mean±S.D.,n=31)

图1 饲料中还原型谷胱甘肽(GSH)的不同水平对牙鲆增重率(WGR)的影响Fig.1 Effects of dietary reduced glutathione(GSH)on the weight gain rate(WGR)ofParalichthys olivaceus

2.2 GSH对牙鲆肝脏中GSH、MDA和T-AOC的影响

如表3所示,随饲料中GSH含量的升高(0～1 063.56 mg·kg-1),肝脏GSH的含量有显著的先升高后下降的趋势。饲料中GSH含量为371.84 mg·kg-1时,肝脏中的GSH含量最高,其值为(27.97±1.77)mg·g-1prot,显著高于饲料GSH零添加组和1 063.56 mg· kg-1组(P<0.05)。

牙鲆肝脏中MDA水平随着饲料中GSH添加量的升高呈现先下降后上升的趋势,但各组间没有显著差异(P>0.05)。

表3 饲料中还原型谷胱甘肽(GSH)的不同水平对牙鲆肝脏GSH、丙二醛(MDA)和总抗氧化力(T-AOC)的影响(平均值±标准差,n=31)Table 3 Effects of dietary reduced glutathione(GSH)on the GSH,malondiadehyde(MDA)and the total antioxidative capacity(T-AOC)in hepatopancreas ofParalichthys olivaceus(Mean±S.D.,n=31)

随着饲料中GSH含量的升高,肝脏中的T-AOC有先升高后降低的趋势,且在饲料GSH含量为371.84 mg·kg-1时达到最高。各处理组T-AOC与对照组差异不显著(P>0.05),但饲料GSH含量为371.84 mg·kg-1时的T-AOC显著高于饲料GSH含量为1 063.56 mg·kg-1时的对应值(P<0.05)。

2.3 GSH对牙鲆肝脏中GPx、GST、GR和SOD活力的影响

如表4所示,随着饲料中GSH含量由0升高到1 063.56 mg·kg-1,肝脏中GPx活力有先上升后下降的趋势,但各组间差异不显著(P>0.05)。

GST活力与GPx的趋势正好相反,有先下降后上升的趋势,并在饲料GSH含量为371.84 mg·kg-1时达到最低,且显著低于其它各组(P<0.05)。

肝脏GR活性除了在饲料GSH含量为1 063.56 mg·kg-1的处理组外,其它各组均显著低于饲料GSH零添加组(P<0.05);饲料GSH含量为371.84 mg·kg-1时, GR活力显著低于其他各组(P<0.05)。

随着饲料中GSH含量的升高,肝脏中的SOD活力有先升高后降低的趋势,且在饲料GSH含量为371.84 mg·kg-1时达到最高。然而,肝脏中SOD的活力没有受到饲料中GSH含量的显著影响(P>0.05)。

表4 饲料中还原型谷胱甘肽(GSH)的不同水平对牙鲆肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、谷胱甘肽还原酶(GR)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响(平均值±标准差,n=31)Table 4 Activities of Glutathione peroxidase(GPx),glutathione S-transferase(GST),glutathione reductase(GR)and the total superoxide dismutase(SOD)in hepatopancreas ofParalichthys olivaceusat different dietary reduced glutathione(GSH)levels(Mean±S.D.,n=31)

3 讨论

谷胱甘肽系统主要是指GSH、GPx、GST和GR。GSH可以在GPx和GST的催化下清除机体内H2O2和脂类过氧化过程的中间产物LOO-或LOOH、防止血红蛋白中的二价铁氧化[21]和清除各种高活性自由基[22],在此过程中GSH本身被氧化生成GSSG;而GSSG可以在GR的催化下,以NADPH为供氢体还原为GSH。当GSSG不能被及时还原为GSH的时候,GSH/GSSG的比值就要发生变化,这个比例的变化,可能是机体内一些含有巯基和二硫键的酶活性发生改变,因此谷胱甘肽在GSH和GSSG状态之间的相互转化,对于维持机体的正常生理状态十分重要[1-2]。

饲料中缺硒会导致虹鳟体内GPx的活性显著降低,同时GST活性显著上升[23]。这表明GST在鱼类体内可以在GPx活性降低情况下作为1个抵抗氧化损伤的保护性机制而存在。此外,GST可以作为反映肝脏损伤的1种敏感指标,当机体受到重金属等氧化损伤时,GST水平变化显著[24]。在本研究中,牙鲆肝脏GSH积累量显著受到饲料中不同水平GSH的影响,在饲料GSH含量为371.84 mg·kg-1时,肝脏GSH积累量最大,且肝脏中GSH的沉积量与T-AOC变化趋势一致,表明了肝脏中GSH的沉积可以提高机体总抗氧化能力。结合本实验中GPx和GST活力变化趋势,表明饲料中适当添加GSH在一定范围内可以促进牙鲆的抗氧化机能发挥作用。然而,当饲料中GSH的含量超过一定水平时(>371.84 mg·kg-1),牙鲆肝脏中GSH的沉积量下降,GPx活力降低,GST活力上升,与刘晓华等[17]在凡纳滨对虾中的研究结果相似,这可能是由于过量的GSH对机体抗氧化能力产生的负面影响[25-27]。本研究中GSH在肝脏中积累量增大时,GR活性水平相应降低,GR在机体内主要是用以维持GSH/GSSG的平衡,这表明体内GSH还原状态的维持可以由外源GSH来辅助调节,而不一定完全由内源性GSSG转化而来。

MDA作为脂质过氧化产物会对机体造成氧化胁迫和细胞损伤[27]。随着饲料中GSH含量的升高,牙鲆肝脏中MDA含量有总体下降的趋势(见表3),这表明饲料中添加适量的GSH能够减少脂质过氧化作用,保护机体免受氧化损伤。大量研究表明,GSH在体内的含量变化会保护蛋白巯基免受氧化损伤[28],在GPx的作用下催化各种亲电子化合物反应,生成无毒性或者毒性小的化合物,以解除有毒物质在体内的积累[8,29-30],GSH在体内的积累能够提高机体清除自由基的能力、提高抗氧化力[19]。本实验中随着饲料GSH含量由0增加到371.84 mg·kg-1时,肝脏T-AOC和GPx活力逐渐升高。GPx作为机体抗氧化酶系的重要组成部分,间接反映了机体自由基反应的动态变化和抗氧化能力[31-32],本实验中GPx活性的升高表明GSH能够提高机体清除有害过氧化物的能力,同时T-AOC的升高也再次证明饲料中添加适量的GSH能够提高牙鲆的抗氧化能力。然而,Thomas等[25]在分子细胞学水平的研究表明,GSH作为氧化物的前体,浓度过高时会产生毒性,从而引起DNA损伤。Sah等[26]和高姝娟等[27]的研究发现,过量的GSH与其它抗氧化剂一样,会引起氧分子生成超氧阴离子。本研究的结果也表明,饲料中GSH的含量超过371.84 mg·kg-1后,会引起牙鲆肝脏中GSH的含量降低(见表3)、T-AOC下降(见表3)、GPx活性下降(见表4)和MDA含量升高(见表3),造成抗氧化能力下降,氧化胁迫升高。

饲料中适当添加GSH能够显著促进牙鲆的生长,这与在草鱼[13]和凡纳滨对虾[17]中的研究结果一致。但对于牙鲆来说,GSH在饲料中的适宜含量为368.92 mg·kg-1,略高于草鱼饲料中的适宜添加量300 mg·kg-1[13]。在对凡纳滨对虾[17]和草鱼[13]的研究中表明,饲料中适量添加GSH可以通过提高胰岛素样生长因子IGF-1的水平而促进动物的生长。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽化合物,其中半胱氨酸脱羧产物半胱胺是辅酶A的组成成分,能够破坏生长抑素分子的二硫键,使生长抑素的生物学功能可逆性丧失,解除生长抑素对生长激素等激素的抑制,促进生长激素的分泌,从而起到促生长的作用,并在鳗鱼[33]和草鱼[34]的相关研究中得到了证实。另外,GSH能够在动物肠腔中起到保护肠黏膜免受毒物和过氧化物的损伤作用[35],从而保护动物消化系统。结合本实验中GSH能够对牙鲆抗氧化机能产生的积极影响,GSH对牙鲆生长的调节作用可能是综合性的,相关机理有待于进一步研究。

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Abstract: The basal diet employed casein and gelatin as main protein sources and was supplemented with reduced glutathione(GSH)up to 0,97.96,189.92,371.84,688.72 and 1 063.56 mg·kg-1diet.In the flowthrough culture system,the Japanese floundersParalichthys olivaceus(initial weight(9.49±0.22)g) were fed with graded levels of dietary GSH,respectively,for 8 weeks to evaluate their growth and antioxidative status.The results showed that survival rate was not significantly affected by dietary GSH levels(P>0.05).The average weight gain rate(WGR)in the treatment with 371.84 mg·kg-1dietary GSH was significantly higher than those in other treatments(P<0.05).The hepatic GSH concentration in dietary GSH added groups was significantly higher than that in dietary GSH deprived group(control group)(P<0.05).No significant differences in hepatic malondiadehyde(MDA)concentration were found between GSH deprived and supplemented groups(P>0.05).The lowest value of hepatic GR activities was found in treatment with 371.84 mg·kg-1dietary GSH(P<0.05).There were no significant differences in the activities of hepatic superoxide dismutase(SOD)and glutathione peroxidase(GPx)among the all treatments(P>0.05).In the group with 371.84 mg·kg-1dietary GSH,the total anti-oxidative capability(T-AOC)was significantly higher than that in the group with 1 063.56 mg·kg-1dietary GSH,however,the GST activity was significantly lower than those in the other groups(P<0.05). Based on the WGR data in the present experiment,a broken-line model was employed to calculate the optimal levels of dietary GSH,which was 368.92 mg·kg-1diet.Deficient or overdose of dietary GSH could cause negative effects on the growth and anti-oxidative capacity ofParalichthys olivaceus.

Key words: Paralichthys olivaceus;feeds;glutathione;growth;anti-oxidative capability

责任编辑 于 卫

Effects of Dietary Reduced Glutathione on Growth and Anti-Oxidative Capability of Japanese Flounder,Paralichthys olivaceus

WANG Fang-Qian,ZHANG Wen-Bing,MAI Kang-Sen,XU Wei,WANG Xiao-Jie,LIUFU Zhi-Guo
(Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

S963

A

1672-5174(2011)04-051-06

国家高技术研究发展计划项目(2007AA09Z437)资助

2010-01-07;

2010-04-27

王芳倩(1984-),女,硕士生。E-mail:wangfq-2007@163.com

E-mail:wzhang@ouc.edu.cn