苦丁茶提取物对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆的影响

周卫华 米长忠 吴仕筠 钟 飞 (吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

苦丁茶是我国南部和西南部民间一种常用植物，民间使用历史悠，其主要分布在桂、粤、黔、琼等地，苦丁茶作为一种植物药茶在我国西部和南部地区广泛的各民族中被广泛饮用。现代药理学研究表明其具有清热解毒、杀菌消炎、健胃消积、止咳化痰、生津止渴、提神醒脑、明目益智和抗辐射、活血脉和调节血脂等功效〔1，2〕。本实验以D-半乳糖致衰老小鼠为模型，观察苦丁茶提取物对D-半乳糖致衰老小鼠的学习记忆力的影响，以便为苦丁茶应用和开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 昆明种2月龄清洁级小鼠40只，雌雄各半，体重(20±2)g，由吉首大学动物中心提供。苦丁茶购自吉首市茶叶店，产地为广西大新县溢江林场。样品已经水蒸气“杀青”、晾干，并经鉴定确认为冬青科苦丁茶。D-半乳糖，购自Sigma公司，用生理盐水配成0.8%的浓度。SOD试剂盒(批号:091006)、MDA试剂盒(批号:091126)均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备 UV-3100紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。TGL-16G低温高速离心机(上海医用分析仪器厂)。

1.3 方法

1.3.1 苦丁茶提取物液的制备 苦丁茶提取液为我室自行制备，流程如下:苦丁茶叶粗粉200 g(粗粉)，15倍量水浸泡20 min，煎煮2 h，共提取2次，合并两次液，浓缩至200 ml，使每毫升含原生药1 g，临用前按比例配制成高剂量为1 g/ml，低剂量为0.5 g/ml。

1.3.2 衰老动物模型的制备与实验分组 实验动物随机分为4组(正常组、模型组、苦丁茶提取物高、低剂量组)，每组 10只。模型组、苦丁茶提取物两个剂量组，颈背部皮下注射0.8%D-半乳糖 0.5 ml/20 g(200 mg/kg)，1 次/d，持续 6 w〔3，4〕，空白组注射同剂量的生理盐水。从第1天开始，苦丁茶提取物两个剂量组每日灌胃10 g/kg(以生药记)、20 g/kg的苦丁茶提取物进行实验干预，模型组和空白组也灌胃等量的生理盐水。

1.3.3 Morris水迷宫实验 采用改良的Morris水迷宫实验，参考聂荣庆等〔5〕的方法，水迷宫为圆形水槽，直径60 cm，高17 cm，水深11 cm，测试过程中室温保持在18℃ ～22℃。在槽壁上等距离地标记4个点分别为NESW，这4个点作为实验起始点。在NW象限中间固定位置处放一透明玻璃平台，高9.5 cm，直径6 cm，使其低于水面1.5 cm。在水面覆盖一层大小相似，直径约为1.5 mm的泡沫颗粒屑，使平台不可见。水槽周围有丰富的固定不变的参照物(包括试验者本身)，以供小鼠定位。参考Williams等〔6〕的方法，训练共历时5 d，分为每天上下午两个时段，每个时段训练四次。训练开始将平台放在NW象限的固定位置处，将小鼠从槽壁四个起始点分别放入水槽中，记录从放入小鼠到小鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)，四次训练分别从不同的起点放入小鼠，小鼠找到平台后，让小鼠在平台上休息30 s，再进行下一次训练。如小鼠120 s仍找不到平台，则由实验者将小鼠放置于平台上，逃避潜伏期记为120 s，也让小鼠在平台上休息30 s。

1.3.4 小鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量测定 实验结束后同一部位的脑组织150 mg，吸干水渍后置入液氮保存。测定前称质量，剪取适量脑组织块，研磨成10%组织匀浆，3 000 r/min离心30 min，取上清液，按试剂盒说明书进行操作，测定上清液中SOD、MDA含量。

2 结果

2.1 苦丁茶提取物对小鼠Morris水迷宫成绩的影响 小鼠用D-gal皮下注射连续6 w后模型组逃避潜伏期延长〔(31.9±8.35)s〕，与正常组相比〔(22.4±5.73)s〕有显著性差异(P ＜0.01)，灌胃给予20、10 g/kg苦丁茶提取物后，逃避潜伏期缩短〔(23.9±7.82)，(25.1±7.2)s〕，与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)，但未能达到正常组水平。

2.2 苦丁茶提取物对小鼠脑组织SOD活性、MDA含量的影响模型组小鼠脑组织SOD活性降低，MDA含量升高，与正常组有显著性差异(P＜0.01)，苦丁茶提取物灌胃给药后小鼠脑组织中SOD活性升高，MDA含量降低，与模型组有显著性差异(P＜0.05)，同样未能达到正常组的水平。见表1。

表1 苦丁茶提取物小鼠脑组织SOD活性和MDA含量的影响(± s，n=10)

表1 苦丁茶提取物小鼠脑组织SOD活性和MDA含量的影响(± s，n=10)

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别 剂量(g/kg)SOD活性(U/mg prot)MDA含量(nmol/mg prot)正常组 － 208.8±36.12) 16.68±1.362)模型组 － 151.1±35.3 19.68±1.76苦丁茶提取物低剂量组 10 177.3±30.71) 18.27±1.081)苦丁茶提取物高剂量组 20 190.2±33.41) 18.01±1.411)

3 讨论

多种动物给予D-半乳糖导致衰老，许多研究证明，该模型动物多种细胞的病理变化也符合自然衰老时出现的症状，并用作抗衰老药物的研究〔7〕。实验结果表明，给予D-半乳糖后，小鼠学习与记忆能力明显下降，模型组与对照组相比，水迷宫实验成绩均明显处于劣势，这说明衰老模型复制是成功的。灌胃给予苦丁茶后，小鼠水迷宫实验均明显优于模型组，苦丁茶能够改善由D-半乳糖诱导衰老小鼠的学习和记忆能力。

D-半乳糖可在体内氧化产生自由基，当超过机体的清除能力时，可引起脂质过氧化作用的链式反应，导致细胞膜损伤〔8〕。自由基可作用于细胞膜，攻击膜磷脂质中的不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物，使膜的结构功能遭到破坏，通透性增加，进一步增强细胞的损伤。SOD是清除自由基最有效酶之一，其活性增高间接证明组织清除自由基能力增强;MDA是自由基伤不饱和脂肪酸生成的脂类过氧化分解产物，降低可间接证明组织中自由基水平降低。有研究表明MDA可引起精神行为改变，并通过交联、结合形成质褐脂质，引起神经系统功能障碍〔9〕。陈薇研究表明，苦丁茶叶中含有多酚和黄酮在体外有较强的抗氧化功能〔10〕。杨彪研究表明，苦丁茶对大鼠离体肝组织的具有一定抗氧化作用，对脂质过氧化有一定的抑制作用〔11〕。D-gal衰老模型小鼠灌胃给予苦丁茶提取SOD活力升高，MDA含量减少，表明苦丁茶提取物可减轻脂质过氧化反应、降低脂质过氧化物的含量、提高机体抗氧化能力和清除自由基能力，这也可能是苦丁茶提取物提高D-gal衰老模型小鼠学习记忆能力、改善衰老的作用机制之一。

1 黄燮才.常用中草药识别与运用〔M〕.第2版.北京:化学工业出版社，2003:364-6.

2 师大亮，余继忠，郭明敏，等.西南苦丁茶药理作用及保健功效研究进展〔J〕.杭州农业科学，2008;1:46-8.

3 龚国清，徐黻本.小鼠衰老模型研究〔J〕.中国药科大学学报，1991;22(2):101-3.

4 朱亚珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老动物模型的建立及其检测方法〔J〕.复旦学报:医学版，2007;34(4):617-9.

5 聂荣庆，张 进，胡国柱，等.脑细胞活性因子对消化素学习、记忆能力的影响〔J〕.中国行为医学科学，2002;11(5):488-9.

6 Williams MT，Morford LL，Wood SL，et al.Developmental D-methamphetamine treatment selectively induces spatial navigation impairments in reference memory in the Morris water maze while sparing working memory〔J〕.Synapse，2003;48(3):138-48.

7 杨红英，李经才.褪黑素对D-半乳糖衰老模型小鼠的作用〔J〕.中国药理学通报，2000;16(4):397-40.

8 崔 旭，李文彬，张炳烈，等.自由基损伤与D-半乳糖所致细胞老化关系〔J〕.基础医学与临床，2000;20(1):24-6.

9 马 虹，徐 镰，苏 平，等.不同水温游泳对小鼠行为、记忆和脂质过氧化影响差异的研究〔J〕.中国应用生理学杂志，1999;15(3):233-4.

10 陈 薇，王恒山，黄世稳，等.大叶苦丁茶抗氧化成分及抗氧化性能研究〔J〕.广西植物，2002;22(5):463-6.

11 杨 彪，龙盛京，覃振江，等.苦丁茶提取物抗氧化作用的研究〔J〕.广西民族学院学报(自然科学版)，2000;6(2):108-10.