甘肃汉、回族2型糖尿病患者PPARγ2基因Pro12Ala多态性分析

关晓丽 刘 怡 刘一帆 陈 慧 (兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030)

遗传因素在2型糖尿病发病中发挥着重要作用，胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的显著病理特征，临床实践已证实噻唑烷二酮(TZDs)以过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)为作用靶点，通过改善胰岛素敏感性而有效降低具有胰岛素抵抗的2型糖尿病患者的血糖水平。目前研究发现PPARγ基因存在多个点突变，主要分布于脂肪组织的PPARγ2，其外显子B的Pro12Ala变异(rs1801282)为目前研究的热点，该多态性与代谢综合征、2型糖尿病、肥胖等代谢病之间具有密切的关系，在不同种族人群中Pro12Ala多态性分布频率不同。甘肃省属于多民族杂居的高寒地区，糖尿病发病率逐年增长，而PPARγ基因突变可能影响TZDs的治疗效果，本课题以我省回族、汉族2型糖尿病患者为对象，进行Pro12Ala多态性分析，以探讨该多态性在2型糖尿病患者的变化及相关性，指导TZDs更佳的使用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 据1999年WHO糖尿病诊断标准确诊的2型糖尿病患者，其中汉族2型糖尿病患者119例，男61例，女58例，年龄27～78岁，平均(59.94±11.75)岁，对照组92例，男45例，女47例，年龄28～59岁，平均(58.88±14.46)岁;回族2型糖尿病患者36例，男20例，女16例，年龄19～75岁，平均(53.86±15.31)岁，对照组32例，男18例，女14例，年龄15～74岁，平均(51.15±16.19)岁，所有2型糖尿病患者均为我院内分泌科住院病人，对照组来自于我院体检中心。入选者三代以上均生活于当地，彼此间无亲缘关系，无明显的慢性肝脏疾病及其他内分泌代谢疾病，无急慢性泌尿系统疾病及其他炎症疾病，无糖尿病酮症。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集、临床及生化检查 测量研究对象的身高和体重，计算体重指数(BMI)=体重/身高2(kg/m2)，各组均于空腹12小时后，次晨抽取肘正中静脉血5 ml，取3 ml分离血清用于生化和胰岛素测定，2 ml EDTA抗凝用于DNA提取。胰岛素抵抗采用稳态模式评估法(HOMA)=(空腹血浆胰岛素浓度×空腹血糖浓度)/22.5，血浆胰岛素浓度、胰岛功能及C肽测定用放射免疫法测定。

1.2.2 基因组DNA的提取 用EZ-10柱式全血基因抽提试剂盒提取外周血DNA。

1.2.3 PPARγ基因型检测 ①引物序列参照Yen等〔1〕的设计，由华大基因科技合成。上游引物5'-GCC AAT TCA AGC CCA GTC-3';下游引物5'-GAT ATG TTT GCA GAC AGT GTA TCA GTG AAG GAA TCG CTT TCC G-3'，(由于 Pro12Ala 多态性DNA序列本身不存在酶切位点，故在引物的设计过程中人为引入错配碱基C);②扩增:PCR反应体系:总体积25 μl，模板 DNA 2 μl，上下游引物各 1 μl，dNTP 2 μl，，10 × buffer 3 μl，Taq 酶0.15 μl(大连 Takara公司)，加双蒸水至 25 μl。96℃预变性3 m，变性96℃ 15 s，退火58℃ 10 s，延伸72℃ 40 s，共30个循环，最后进一步延伸72℃7 m;③酶切:20 μl体系，双蒸水7 μl，酶切 buffer 2 μl，MspI 酶(Promega 公司)1 μl，PCR 产物10 μl。在冰浴中完成加样后离心，置37℃恒温水浴锅中酶切过夜，取出后在65℃水浴中加热5 m，立即 －20℃保存;④电泳:取酶切产物5 μl进行浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳，水平电泳槽 70 V，电泳约 40 min，以 DNA片段长度标准物(DL500Marker)为参考，紫外灯下观察结果并照相。

1.3 统计学分析 根据Hardy-weinberg平衡定律检测基因型群体代表性。正态分布的计量资料两两比较采用t检验(Levene方差齐性检验)，方差不齐时用Dunnet法比较，基因型频率用计数法获得(基因频率=基因型х2)，组间基因型频率及等位基因的频率的比较采用pearson χ2检验和校正的χ2检验，所有统计分析均采用SPSS13.0统计学软件进行。

2 结果

2.1 PPARγ2基因Pro12Ala多态性分析 该基因扩增后，PCR产物长度为267 bp，应用MSPI限制性内切酶酶切后，可产生三种基因型:野生型(PP)被酶切后产生两条片段，分别为225 bp，42 bp;杂合突变型(PA)可产生三条片段，分别为267 bp，225 bp，42 bp;而纯和突变型(AA)不能被酶切，产生一条片段，267 bp(见图1)。所有研究对象均以野生型为主。

图1 PPARγ2基因Pro12Ala基因型

2.2 甘肃汉、回族2型糖尿病组和对照组PPARγ2、Pro12Ala基因型与等位基因频率分布 在汉族中，以PP基因型为主，也存在纯合突变，差异不具有统计学意义(χ2=0.157，P=0.925)，A等位基因在糖尿病组和对照组分别为4.62%，4.89%，差异不具有统计学意义(χ2=0.017，P=0.897);在回族中，基因型的分布不具有统计学差异(χ2=0.157，P=0.925)，A等位基因在糖尿病组和对照组分别为4.17%，4.69%，差异不具有统计学意义(χ2=0.022，P=0.883)。

2.3 汉、回族2型糖尿病PPARγ2基因中Pro 12Ala多态性与临床变量的比较 两组中，携带A等位基因的2型糖尿病患者BMI，空腹血糖(FBG)，甘油三酯(TC)均较P等位基因者低，总胆固醇(TC)含量较高，但差异不具有统计学意义(P＞0.05)。

2.4 汉、回族2型糖尿病患者PPARγ2基因中Pro12Ala多态性比较 汉族与回族2型糖尿病患者PPARγ2基因中Pro12Ala多态性位点均以PP基因型为主，A等位基因频率分别为4.62%，4.17%，差异不具有统计学意义(χ2=0.027，P=0.871)。见表1。

表1 汉、回族2型糖尿病患者PPARγ2基因中Pro12Ala多态性比较〔n(%)〕

3 讨论

人PPARγ基因位于染色体3p25。该基因有多种单核苷酸突变，与肥胖、胰岛素抵抗及糖尿病等多种疾病相关，研究最为广泛的是B外显子的一个错义突变，脯氨酸(CCA，Pro)变为丙氨酸(GCA，Ala)，因错义突变正好发生在第12个氨基酸处，故被称为Pro12Ala。PPARγ2的氨基端含有一个不依赖于配体而依赖于胰岛素的活化区域，Pro12Ala即位于该区域内，可引起蛋白构象的改变，使其结合靶基因能力下降，导致转录活性下降，蛋白质活性改变，从而影响其功能。

2型糖尿病作为一种慢性的非传染性多基因遗传异质性疾病，其病因较复杂，通常认为其发病与遗传及环境均有密切的关系，英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)〔2〕发现糖尿病发病与种族和民族有着密切的关系，国内大量研究〔3〕也发现，由于生活习俗等差异，少数民族糖尿病及其并发症的患病率较汉族略高，基因水平的研究也发现有种族和民族差异性。Pro12Ala是PPARγ2基因中较常见的多态性改变，Deeb等〔4〕1998年首次报道了PPARγ2基因Pro12Ala多态性与日本裔美国人2型糖尿病有显著相关性，且在不同种族人群中的分布频率不同〔5〕，中国人群Pro12Ala多态性位点以PP基因型为主，A等位基因频率为2%～4%，日本人4%，而欧美人群占10%左右。本研究回族与汉族间2型糖尿病组突变A等位基因频率分别为4.17%，4.62%，与国内其他报道〔6，7〕基本一致，与日本人相近，但显著低于欧美人。结果表明，PPARγ2基因Pro12Ala多态性均以PP基因型为主，回、汉两民族间及民族内基因型和等位基因频率间均无显著性差异，提示该多态性在回、汉两个民族间不存在民族差异。

Deeb等〔4〕认为A等位基因携带者具有高胰岛素敏感性和低体重指数，可能更少罹患2型糖尿病，这一结论后又被欧美白种人的大样本的研究〔8〕所证实，国内部分研究结论亦与此一致〔9〕，认为P等位基因携带者更易于发生胰岛素抵抗，可能更需要胰岛素增敏剂治疗。对两组人群各种临床及生化指标进行比较发现，携带有A等位基因者空腹血糖、体重指数，甘油三酯水平较P等位基因略低，提示可能有一定程度的改善胰岛素敏感性、降低体重等作用，但未发现统计学差异，尚不能明确甘肃汉族和回族2型糖尿病患者与PPARγ2基因Pro12Ala多态性之间有明显关联性，这与国内部分地区报道〔10，11〕相一致，但亦不能完全否认A等位基因携带者使用TZDs会更加有效这一研究结果，因未进一步进行分层分析，尚未明确该多态性与血脂及肥胖之间的相关性。

综上所述，PPARγ2基因Pro12Ala多态性在甘肃回族和汉族人群中以PP基因型分布为主，两民族间该多态性分布不存在统计学差异;该多态性与甘肃回族和汉族人群2型糖尿病患病之间尚未得到相关性结论。2型糖尿病是一种多基因病，其发病是由于多个微效基因及环境因素共同作用的结果，该多态性突变率较低，且多态性效应可能被遗传和环境因素所修饰，如肥胖、血脂紊乱等，也可能与研究对象间生活方式及饮食习惯无明显差异有关，亦不排除样本量太小及抽样误差等原因造成偏差，需进一步扩大样本量等。

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4 Deeb SS，Fajas L，Nemoto M，et al.Pro12Ala substitution in PPARγ2 associated with decreased receptor activity lower body mass index and improved insulin sensitivity〔J〕.Nat genet，1998;20:284-7.

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7 傅 健，池上博司，吕远栋，等.过氧化物酶体增殖物激活受体γ2基因Pro12→Ala可能是我国汉族人2型糖尿病的保护性等位基因〔J〕.中国糖尿病杂志，2005;13(5):363-5.

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9 荻原俊男，傅 健，池上博司，等.过氧化物酶体增殖物激活受体γ2基因Pro12→Ala可能是我国汉族人2型糖尿病的保护性等位基因〔J〕.中华糖尿病杂志，2005;13(5):363-5.

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