桔梗总皂苷对2型糖尿病大鼠肝脏并发症的治疗作用

栾海艳 欧 芹 赵晓莲 王景涛 贾琳琳 齐淑芳 杨利敏 王伟群 王显钢

(佳木斯大学基础医学院 佳木斯大学儿童神经康复实验室，黑龙江 佳木斯 154007)

2型糖尿病(T2DM)的并发症不仅包括肾脏、心脏、视网膜和神经病变，肝脏亦为其长期高血糖累及的靶器官之一。药理学研究表明桔梗有显著降糖和保肝作用〔1〕，但对DM肝脏并发症的影响还未见报道。本文主要研究桔梗中重要有效部位桔梗总皂苷对DM肝脏并发症的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组 纯系Wistar大鼠48只，清洁级，体重180～220 g，雌雄各半，购于佳木斯大学实验动物中心。同室分笼饲养于标准环境，自由进水、饮食，12 h光照周期。所有大鼠正常饲养1 w后，随机分为2组:正常对照组(8只)饲以正常饮食，DM组(40只)饲以高脂高糖饮食。喂养4 w后，DM组大鼠隔夜空腹尾静脉一次性注射2%链脲佐菌素(STZ)25 mg/kg，正常对照组仅注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，DM组继续饲以高脂高糖饮食4 w。9 w末DM组禁食18 h后，进行空腹血糖(FPG)及肝功测定，FPG≥16.8 mmol/L、肝功异常为造模成功〔2〕。将造模成功的24只T2DM肝脏并发症模型大鼠随机分为2组:模型对照组(DM组)和桔梗总皂苷治疗组(TSP组)，继续高脂高糖饮食;喂饲基础饲料的8只作为正常对照组(NC组)。

1.2 方法

1.2.1 给药方案 从第10周起TSP组给予桔梗总皂苷水溶液200 mg·kg－1·d－1灌胃，1次/d;NC组和DM组给予等体积蒸馏水灌胃。药物干预12 w，整个实验共持续21 w。

1.2.2 留取标本及检测指标 实验结束后，称量每只大鼠体重。禁食18 h后，乙醚麻醉，断头取血，检测FPG、肝功等生化指标;迅速剖取肝脏，称量湿重，计算肝脏指数;肝组织切成小块，置于液氮中，冻透后转入－80℃保存，待测肝组织中转化生长因子(TGF)-β1及Smad-4 mRNA的表达水平。

1.2.3 检测试剂 STZ为美国Sigma公司产品;RT-PCR试剂盒、Trizol总RNA试剂、DNA marker均购于南京凯基生物科技发展有限公司;引物由北京奥科生物技术有限公司设计兼制作;FPG、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.2.4 检测指标 ①FPG、ALT、AST检测采用全自动生化分析仪;②TGF-β1及Smad-4 mRNA的表达采用RT-PCR法检测，以β-actin作为内参照。引物序列如下:β-actin上游 5'TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA 3'，下游 5'TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3';TGF-β1上游 5'GAG CCC GAG GCG GAC TAC TAC 3'，下游 5'CAG GAA GGG TCG GTT CAT GTC 3';Smad-4上游5'TAA AGG TGA AGG GGA CGT GTG 3'，下游 5'CAT GGT GTG CAG GAC TTC ATC 3'。反应产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，BIO-BEST型凝胶成像分析系统拍摄并分析。结果以目的基因与β-actin吸光度的比值定量TGF-β1及Smad-4基因表达水平。

2 结果

2.1 各组大鼠治疗后FPG、肝功及肝脏指数变化 与DM组相比，TSP组的FPG含量明显降低(P＜0.01)，且已达正常标准，ALT明显降低(P＜0.05)，AST含量明显降低(P＜0.01)，肝脏指数明显降低(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠治疗后血糖、肝功及肝脏指数变化(± s，n=8)

表1 各组大鼠治疗后血糖、肝功及肝脏指数变化(± s，n=8)

与NC组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05;与 DM 比较:3)P＜0.01，4)P＜0.05;下表同

组别 FPG(mmol/L) ALT(U/L) AST(U/L)肝脏指数NC组9.43±2.17 63.17±16.07 97.50±9.50 2.25±0.21 DM组 19.20±4.231) 119.50±35.491)283.83±23.641) 4.39±0.281)TSP组14.05±2.121)3)92.00±16.522)4)202.67±19.571)3)3.10±0.101)3)

2.2 各组大鼠治疗后肝组织中TGF-β1及Smad-4 mRNA表达的变化 与DM组相比，TSP组肝组织中TGF-β1mRNA的表达明显减少(P＜0.01)，Smad-4 mRNA表达明显减少(P＜0.05)。见表2，图1。

表2 各组大鼠治疗后肝组织中TGF-β1及Smad-4 mRNA表达的变化(± s，n=8)

表2 各组大鼠治疗后肝组织中TGF-β1及Smad-4 mRNA表达的变化(± s，n=8)

组别 TGF-β1/β-actin Smad-4/β-actin NC组0.383±0.063 0.224±0.029 DM组 1.553±0.0961) 0.418±0.0431)TSP组 1.062±0.0781)3) 0.373±0.0211)4)

图1 TGF-β1及Smad-4 mRNA的表达

2.3 TGF-β1与Smad-4 mRNA表达的相关性分析 TGF-β1与Smad-4 mRNA表达呈显著正相关(r=0.981，P＜0.01)。

3 讨论

T2DM肝脏并发症的发生与血糖长期控制不良有密切关系，长期发展可致脂肪肝、肝纤维化和肝癌等疾病。TGF-β1是目前研究最深入的与肝脏病变密切相关的细胞因子。TGF-β1可调节细胞的生长、分化、基质产生和凋亡;在胚胎生长发育过程中，对模型形成和组织特异性分化起重要作用。研究证实在病理条件下，过量的 TGF-β1将导致细胞外基质(extracellularmatrixc，ECM)的过度产生而诱发纤维化。TGF-β1在纤维化的起始和持续发展中起关键作用〔3〕，它对组织细胞的作用是通过复杂的信号传导系统来完成的。在该系统中除了TGF-β1及其受体外还有许多蛋白特别是Smads蛋白的参与，而Smad-4是哺乳动物中目前发现的唯一一个Co-Smads，它的作用不同于Smads家族的其他成员，不仅是TGF-β/activin信号通路中必需的信号中转分子，而且可以与所有活化的受体调节型Smads蛋白结合，作为共同递质和磷酸化的受体调节型Smads相结合形成异低聚体复合物后转运至细胞核中激活转录应答。

本研究结果表明，桔梗总皂苷能通过上述途径改善和减缓肝脏并发症进程。当然桔梗总皂苷还有许多有待发掘的作用，作为传统中药其应用前景广阔。

1 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部〔S〕.北京:化学工业出版社，2005:196.

2 胡爱民，肖凤英，郑 云.2型糖尿病并脂肪肝实验性大鼠模型的建立及评价〔J〕.中国中西医结合消化杂志，2006;14(3):156-9.

3 Border WA，Noble NA.Transforming growth factor beta in tissue fibrosis〔J〕.N Engl J Med，1994;331(19):1286-92.