小檗碱对泼尼松性大鼠脑损害的防治作用

陈文双 张新乐 徐道华 (广东医学院药理教研室，广东 湛江 524023)

长期大剂量使用糖皮质激素对脑损害的作用十分突出。血浆中高水平的糖皮质激素持续作用可以透过血脑屏障进入脑组织，危害中枢神经系统〔1〕。为探讨小檗碱在改善泼尼松性大鼠脑损害方面的作用，本研究拟采用大剂量醋酸泼尼松致大鼠脑损害模型，观察泼尼松对大鼠脑组织单胺氧化酶(MAO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及脑组织结构的影响，以及小檗碱对泼尼松大鼠脑损害的防治作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SPF级3月龄SD大鼠50只，雄性，250～285 g，广东医学院实验动物中心提供。按体重随机分成5组，每组10只，空白对照组(Con组)，予蒸馏水5 ml/kg灌胃1 h后再予蒸馏水 5 ml/kg灌胃;泼尼松组(GC组)，予泼尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后再予蒸馏水5 ml/kg灌胃;小檗碱低剂量组〔GC+Ber(L)组〕，先予泼尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后予小檗碱15 mg/kg灌胃;小檗碱中剂量组〔GC+Ber(M)组〕，先予泼尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后予小檗碱30 mg/kg灌胃;小檗碱高剂量组〔GC+Be(H)组〕，先予泼尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后予小檗碱60 mg/kg灌胃。1次/d，所有动物给药时间为12 w。

1.2 方法

1.2.1 试剂、药品与仪器 小檗碱(纯度95%，Sigma公司)，临用前用蒸馏水配制;醋酸泼尼松(纯度99%，浙江仙居药业有限公司)，临用前用少许吐温-80溶解后用蒸馏水稀释至所需容积;MAO测定试剂盒、SOD测定试剂盒和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。仪器:ELX800型酶标仪(美国BD-Tek公司)，752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，LEICA QWIN图像分析仪(德国莱卡公司)，ZS832I型内切式组织匀浆机(浙新机械厂)，ASD23D爱华电子秤(深圳市爱华仪器有限公司)。

1.2.2 模型制备 采用醋酸泼尼松3.5 mg/kg灌胃大鼠，1次/d，连续给药12 w，建立泼尼松致大鼠脑损害的模型。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 脑匀浆生化指标测定 大鼠右心室取血后，迅速断头，立即取出完整大脑，左侧大脑先于－20℃预存，48 h内在冰浴上用4℃生理盐水研磨制成10%脑匀浆，再经ZS832I型内切式组织匀浆机充分粉碎，离心取上清检测MAO、SOD和脑匀浆蛋白含量。

1.2.3.2 脑组织切片标本制备方法 打开大鼠颅骨，取出完整大脑，观察外观有无特征性改变;然后将右侧大脑用Bouin固定液固定进行常规石蜡包埋切片。根据包新民等〔2〕大鼠脑立体定位图谱在距离前囟向尾侧3～4 mm处修理组织块，行冠状切片，在距离前囟向尾侧约3.5 mm处连续切片5～8张，厚4 mm，经HE染色后，分别于高倍光镜下观察组织结构变化，并用半自动图像分析仪测算海马CA2区单位面积神经元数目(大锥体细胞计数)，测量大鼠大脑纹状区皮质分子层厚度和皮层总厚度。

2 结果

2.1 小檗碱对泼尼松大鼠脑匀浆生化指标的影响 见表1。与空白对照组比较，泼尼松组大鼠大脑匀浆中MAO含量显著升高(P＜0.01)，而SOD的含量变化不明显，提示长期使用泼尼松可使大鼠神经系统功能活动受到限制，出现衰老的迹象。与泼尼松组比较，小檗碱高、中、低剂量组均可显著降低MAO的含量(P＜0.01)，提示小檗碱可在一定程度上可对抗泼尼松的中枢性不良反应。

2.2 小檗碱对泼尼松大鼠脑组织结构影响 打开大鼠颅骨，取出完整大脑时，观察各组大鼠大脑外观无显著差异，未见明显的肿胀、萎缩或颜色变化。显微镜下可见空白对照组海马神经元分布规则，大小一致;而长期使用泼尼松后大鼠海马CA2区神经元排列分散，胞体肿胀或皱缩，有较多的神经细胞发生核固缩甚至溶解死亡。小檗碱预防药物组海马CA2区神经元排列较规则，正常形态的神经元细胞数目较多(图1)。通过图像分析仪测量，与空白对照组比，长期应用泼尼松后大鼠海马CA2区单位面积大锥体细胞数(HN)明显下降(P＜0.01)，分子层厚度和皮层的总厚度比值(M/C)无显著变化，提示长期超生理剂量使用泼尼松可造成大鼠海马神经元的损伤。与泼尼松组比较，小檗碱高、中、低剂量组HN均显著上升(P＜0.01)，M/C无明显变化，提示小檗碱对泼尼松造成的神经细胞损伤有一定的预防作用。见表2。

表1 小檗碱对泼尼松大鼠脑匀浆SOD活性与MAO含量的影响(± s，U/mg prot，n=10)

表1 小檗碱对泼尼松大鼠脑匀浆SOD活性与MAO含量的影响(± s，U/mg prot，n=10)

与Con组比较:1)P＜0.01;与GC组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01，下表同

?

表2 小檗碱对泼尼松大鼠脑组织结构的影响(± s，n=10)

表2 小檗碱对泼尼松大鼠脑组织结构的影响(± s，n=10)

CW:大脑皮层厚度

?

图1 各组大鼠海马CA2区神经元细胞(锥体细胞)形态(HE，×400)

3 讨论

目前临床医师对糖皮质激素的急性期不良反应比较重视，如高血压、高血糖、尿糖、胃肠出血和穿孔、心肌肥厚及对下丘脑-垂体-肾上腺轴一过性的抑制作用等〔3，4〕，对远期中枢神经系统的不良反应却未引起足够重视。而大量动物实验表明，糖皮质激素治疗对脑发育有不良影响，糖皮质激素通过抑制脑胸腺嘧啶脱氧核苷酸激酶(可调节DNA的合成速度)的活性，影响嘧啶核苷酸的生物合成，使脑细胞数目明显减少、脑重量减轻，从而导致生长发育明显延迟〔3〕。实验中泼尼松组大鼠脑匀浆中MAO含量显著上升，提示糖皮质激素造成的脑损害与其脑中神经递质含量紊乱有关。海马是脑内参与记忆的重要部分，其结构的改变往往提示记忆功能下降，记忆衰退是生物体出现衰老的一个早期症状〔5〕。糖皮质激素损伤海马的机制可能与加速神经元内ATP消耗，引起细胞器退行性变和能量的大量消耗有关〔6〕。本实验结果也显示长期使用糖皮质激素可造成海马神经细胞死亡或加速神经元退化。

本实验显示，小檗碱对长期超生理剂量应用糖皮质激素导致的脑损害有一定预防作用。小檗碱通过减低局部缺血损伤和N-甲基天冬氨酸受体1免疫反应性〔7〕保护神经用。另外，小檗碱通过增加海马和额叶皮质中去甲肾上腺素(NA)和5-羟色胺(5-HT)的表达水平，也起到调节神经系统的作用〔8〕。

1 孙红宇.糖皮质激素对海马神经元影响的体外研究 (硕士论文)〔D〕，2002:2.

2 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.北京:人民卫生出版社，1991:41-53.

3 Stark AR，Carlo WA，Tyson JE，et al.Adverse effects of early dexamethasone in extremely-low-birth-weight infants〔J〕.N Engl J Med，2001;344(2):95-101.

4 Anday EK，Conway D.Steroid therapy in the high-risk neonate:benefits and risks〔J〕.Clin Obstet Gynecol，2003;46(1):190-210.

5 张 兵，侯家骥.大鼠海马CA1区锥体细胞神经元在衰老过程中的超微结构变化〔J〕.神经解剖学杂志，1995;1(3):249-52.

6 王旭明，朱吉林，黄 瀛.持续糖皮质激素增高对海马的毒性作用〔J〕.解剖学杂志，1996;19(1):48-5.

7 Yoo KY，Hwang IK，Lim BO，et al.Berberry extract reduces neuronal damage and N-Methyl-D-aspartate receptor 1 immunoreactivity in the gerbil hippocampus after transient forebrain ischemia〔J〕.Biol Pharm Bull，2006;29(4):623-8.

8 Peng WH，Lo KL，Lee YH，et al.Berberine produces antidepressant-like effects in the forced swim test and in the tail suspension test in mice〔J〕.Life Sci，2007;81(11):933-8.