基于方证相应学说探寻肾阴虚证的标志蛋白质*

李俊丽，李 涢，刘铭福，张 杰

（中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700）

本研究以中医方证相应学说为依据，运用蛋白质组学技术来探寻肾阴虚证标志蛋白质，以求在蛋白质表达水平发现肾阴虚证的物质基础，为证本质的研究开辟一条新的研究途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明系小鼠，雄性，购自中国中医科学院动物室。

1.1.2 方剂组成及处理 左归饮：由熟地12g，山药 6g，枸杞子 6g，炙甘草 3g，茯苓 6g，山萸肉5g组成，上述中药冷水浸泡30min，煎煮2遍和并煎液，浓缩为 100ml，含生药 0.38g/ml。

1.1.3 主要试剂 丙烯酰胺（Arc）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、三（羟甲基）氨基乙烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸胺（APS）、二硫苏糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、尿素均为Sigma公司产品；硫脲为Fluka公司产品；硫代硫酸钠、无水碳酸钠、乙醇、冰醋酸、甘氨酸均为国产分析纯；固相 pH梯度干胶条（IPG dry strip PH3～10NL，18cm）及其 IPG缓冲液、蛋白酶抑制剂及蛋白酶标准及考马斯亮蓝均购自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 昆明系雄性18月龄小鼠，随机分为左归饮组和老年肾虚证模型组，每组20只。左归饮组：将左归饮以8倍人剂量以灌胃形式给予小鼠，每日1次，每灌服6d停药1d，连续给药2个月。停止给药时，小鼠达20月龄。老年肾虚模型组：以同体积水灌胃小鼠，方法同给药组。青年正常对照组：选用2月龄小鼠为青年正常对照组。

1.2.2 动物取材及蛋白质提取 给药结束后，取小鼠其血清、肝、肾、睾丸组织，置于-80℃保存备用。蛋白质提取：分别快速取各组小鼠肝、肾、睾丸组织约150mg，于液氮中迅速研磨。研磨后转入eppendorf管中，加入 0.5ml组织裂解液（（Tris（40mM），尿素（7M），硫脲（2M），4％CHAPS（两性离子去污剂），1％二硫苏糖醇，乙二胺四乙酸二钠（1mM））。同时加入 1 ×Cocktail（混合物）蛋白酶抑制剂。将含裂解液的eppendorf埋入冰中，超声破碎，3～4s/次，间隔 10s左右，至溶液透明。加入DNase I（10μ /μl）、RNase A（10μ /μl）各 5μl，4℃ 静置 30min。4℃14000r/min，离心 30min。血清去高峰度蛋白处理：选用德国 QIAGEN生产的 Albumin and IgG Depletion试剂盒处理血清高峰度蛋白。取少量上清用 Bradford法测定蛋白浓度，其余上清-80℃保存。

1.2.3 双向凝胶电泳 第一向等电聚焦（IEF）：使用 pH3～10NL，18cm IPG预制胶条，在IPG 持胶槽中加入 7μL DTT（1M），1.75μL IPG 缓冲液（pH3～10），组织蛋白提取物（含500μg蛋白），最后加入重泡胀液（8M尿素，4％CHAPS），使总体积为350μL。将IPG胶条置入持胶槽中于聚焦仪上进行等电聚焦电泳。电泳条件为：重泡胀（不加电压）1h；30V电压 10h；500V、2000V、5000V电压各30min；最后稳定在8000V下进行，总电压时间积为8万 Vh。

第二向SDS-PAGE使用自制凝胶在Ettan DALT six Electrophoresis Unit上进行电泳。第一向聚焦后的胶条，分别在平衡A液（1mM DTT，50mM Tris pH 8.8 ，6mM 尿素，30％ 甘油，2％SDS ，0.002％ 溴酚兰）与平衡 B液（2.5％碘乙酰胺，50mMTris pH 8.8 ，6mM 尿素，30％ 甘油，2％SDS，0.002％ 溴酚兰）中各平衡15min。将平衡后的 IPG胶条转移至13％的聚丙烯酰胺凝胶上端，使IPG胶条与凝胶上端紧密贴合，在一端加入凝胶电泳蛋白质标准品。电泳条件为：每胶20mA 40min后再以每胶30mA电泳，直至溴酚兰指示线到达凝胶底边处停止电泳。

1.2.4 考马斯亮蓝染色 电泳结束后取出胶版，考马斯亮蓝 R-350染色液（0.1％）染色1h，考马斯亮蓝脱色液（7％乙酸5％甲醇）12h。

1.2.5 凝胶图像分析 凝胶通过 UMAX Power Look 2100XL扫描，凝胶数据储存，采用 Image Master 2D Platinum 6.0软件进行凝胶的蛋白点检测、背景消减及匹配，配合人工校正等方法，以保证其过程的准确性。

1.2.6 质谱鉴定 切取目的蛋白质点送北京华大蛋白质组研发中心，由MALDI-TOF质谱仪进行质谱分析，获取蛋白样品的肽质量指纹图，最后应用Mascot软件在人类蛋白质公共数据库（NCBI）中搜寻，获得蛋白质的相关信息。

1.2.7 Western blot验证肾脏标志蛋白表达提取小鼠肾组织总蛋白，用 Braford法检测蛋白含量，使用 BIO RAD Mini-PROTEAN凝胶电泳仪，样品浓度为30ug，电泳 1.5 h后取胶，用 BIO RAD转膜仪进行湿转。转膜时滤纸、PVDF膜、胶的位置为：滤纸-胶-PVDF膜-滤纸；转膜条件：14 V 10℃冰柜过夜。转完后放入 Tris-NaCl中清洗10 min转入5％脱脂奶粉中封闭2 h，用PBST洗涤3次，每次10 min，孵一抗室温 2 h，取出后 PBST洗涤 3次，每次10 min，孵二抗室温 2 h，PBST洗涤 3次，每次 10 min。然后，在 PVDF膜上加入 ECL Plus底物溶液，用 Image Quant 400凝胶成像仪测化学发光。

2 结果

2.1 双向凝胶电泳与图像分析结果 经Image Master 2D Platinum 6.0软件分析，在相同条件下识别的蛋白质点个数肝组织为1484±32个，肾组织为1301±28个，血清为 318±34个，睾丸组织为1027±21个。根据3倍差异表达做为标准，共检测出左归饮将肾阴虚模型组非正常表达的蛋白质调节纠正为正常表达的蛋白质点为23个，图1为各组织蛋白质表达图谱，图2为肝组织中异常表达蛋白质各组比较。

2.2 差异蛋白点质谱鉴定结果

对24个差异蛋白质点进行酶解、质谱分析得到PMF图谱后，查询 NCBInr 20100928数据库，其中4个点由于数据搜索蛋白的分数不具有统计学意义而未得到鉴定，因此20个蛋白质点得到鉴定（结果如表1）。图3为5号差异蛋白质点的肽质量指纹图谱，检索 NCBInr20100928数据库显示为apolipoprotein A-I，图4为5号差异蛋白质点的分数直方图，直方图显示5号蛋白质 apolipoprotein A-I的得分为93分。

图1 各组织蛋白质表达图谱

2.3 Western blot验证肝脏 Arginase-1蛋白和肾脏 Aminoacylase蛋白表达结果

Arginase-1蛋白在各组小鼠中均有表达，在老年肾虚模型组表达水平较低，明显低于青年正常对照组和左归饮组，说明老年肾虚证小鼠体内Arginase-1蛋白表达较低，经左归饮调节后其表达恢复正常，这与凝胶分析和质谱分析结果相符（图5）。Aminoacylase蛋白在各组小鼠中均有表达，在老年肾虚模型组表达水平较低，明显低于青年正常对照组和左归饮组，说明老年肾虚证小鼠体内Arginase-1蛋白表达较低，经左归饮调节后其表达恢复正常，这与凝胶分析和质谱分析结果相符（图6）

图2 左归饮将肾阴虚模型组肝组织中非正常表达的蛋白质调节纠正为正常表达的蛋白质点

表1 肾阴虚证小鼠蛋白质鉴定结果及其表达变化情况

图3 5号差异蛋白质apolipoprotein A-I的肽质量指纹图谱

图4 5号差异蛋白质apolipoprotein A-I的分数直方图

图5 各组Arginase-1蛋白的表达

3 讨论

方证相应学说是对方剂与证候两者间关系的一种阐述。方证相应指的是一个方剂的功效和方剂内的药味及其配伍与其所对应的证之间存在着高度的统一性和针对性［1］。方证相应强调方与证的对应，有是证用是方，方为证立，方随证转。方证相应才是有效方，不对应就是无效方。中医经过长期的临床实践，逐渐认识和确立了一些典型的证候，在临床选药组方治疗这些证候时，经长期的反复验证，形成了一批对这些证候确有疗效的经典方剂。这些方剂配伍严谨，指征明确，只要对证用药，临床疗效比较肯定。这些方，后世称之为“经方”、“古方”，这些典型的证候和对这些证候确有疗效的经典方剂被认为达到了方与证的相应，是公认的有效方。在此基础上，我们设计出了探寻证候物质基础的新方法：将某一方剂在治疗相应证候的患者或动物模型时所调节纠正的那些物质视为该证候的物质基础。因为正是该方剂在机体内发挥其药理作用的过程中调节纠正了这些物质后，才使该证候的临床 症状得以缓解或消失。如果能找出这些物质也就是找到了证的物质基础。

图6 各组Aminoacylase蛋白的表达

肾虚证是中医典型的证候，中医认为老年生理性肾虚动物模型一般属肾阴、阳两虚型，出自《景岳全书》的左归饮和右归饮是对老年肾虚证确有疗效的经典方剂，它们分别具有“滋阴补肾，填精益髓”和“温补肾阳，填精益髓”的功效。本课题选用老年小鼠为肾虚证动物模型，选用滋补肾阴的左归饮和温补肾阳的右归饮为相应方剂，对老年小鼠肾虚证动物模型进行干预。取各组动物相关的组织脏器做蛋白质双向电泳。将青年正常组、肾虚模型组和肾虚模型给药组动物各组织脏器的电泳图谱进行分析与互相对比，找出两方剂，将肾虚模型组与青年正常组表达差异的蛋白质调节纠正为青年正常组所表达的蛋白质，这些蛋白质即为肾虚证标志蛋白质。本文为左归饮干预老年小鼠肾虚证动物模型的实验结果，其调节纠正的蛋白质应为肾阴虚证的标志蛋白质。

实验结果表明，肾阴虚证的标志蛋白质主要有分子伴侣蛋白、参与物质代谢的蛋白质、细胞骨架、高密度脂蛋白、未知蛋白质等。

HSP70是热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族中的重要一员，是生物细胞中含量最高，诱导性最强热休克蛋白。HSP70提高细胞对应激源的耐受性。HSP70通过分子伴侣作用，可与细胞内变性蛋白质结合，促进变性蛋白质的修复、降解和清除。HSP70可抑制热休克、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、单核细胞、氧化应激等诱导的细胞凋亡［2］。阻断或抑制 HSP70可诱导细胞凋亡，而HSP70的高表达则能抑制细胞凋亡［3，4］。HSP70 具有抗氧化作用，被誉为“细胞内具有抗氧化能力的急性期蛋白”［5］。HSP70 可抑制白细胞介素-1（IL-1）、TNF-α等炎症介质的表达，抑制细胞因子介导的炎性反应，起到非特异性免疫保护作用［6-7］。此外，HSP70在抗感染免疫、肿瘤免疫、自身免疫中也具有重要作用。本次研究结果显示，肾阴虚证小鼠组织中HSP70显著升高，可能是肾阴虚证状态下，各种刺激引起机体的应激反应，从而出现 HSP70高表达，以提高机体的应激耐受能力。而且，在孙晓敏等［8］的关于肾阴虚证研究中发现了HSP27异常表达，HSP70与HSP27都属于热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族，这也说明热休克蛋白与肾阴虚证的发生、发展具有密切关系。

值得注意的是，本次研究发现的参与物质代谢的蛋白质，有2个蛋白质和我们另一个研究结果相同［9］。其中一个蛋白是 Eno1，Eno1是糖酵解中ATP合成的关键酶，能促使 α-磷酸甘油酸脱水向磷酸烯醇式丙酮酸的转化，同时也在糖异生过程中催化逆向反应［10］。Eno1存在于大多数组织内，是糖酵解过程的限速酶，它在肾阴虚模型动物体内的表达量增加能引起糖酵解和糖异生的增多，说明肾阴虚证动物糖代谢增强，这符合中医阴虚生内热的理论。

另一个蛋白是氨甲酰磷酸合成酶1（carbamoylphosphate synthetase 1），氨甲酰磷酸合成酶是尿素合成的限速酶，通过水解一分子 ATP的2个高能磷酸键，氨甲酰磷酸合成酶催化 NH4+与 HCO3-活化并缩合形成氨甲酰磷酸，之后其进入到鸟氨酸循环最终形成尿素。因此，氨甲酰磷酸合成酶 1表达量的减少能减慢鸟氨酸循环，由此可见肾阴虚动物氨基酸代谢减慢，说明此时蛋白质分解代谢降低。

Ezrin是 ERM（ezrin radixin moesin）细胞骨架连接蛋白家族的一员［11］。ERM家族最初被认为仅仅是连接细胞膜蛋白和胞内肌动蛋白的结构，最近发现其参与了许多细胞的生理功能［12］。ERM家族蛋白参与细胞膜表面特殊结构的组成，并且协助某些小分子物质锚定在特定的部位［13］。Ezrin是细胞表面结构的组成部分，参与了细胞与胞外基质的黏附、细胞间的相互作用、受体酪氨酸激酶和 Rho GTPase的信号传导以及 Akt介导的细胞凋亡作用等［14、15］。

载脂蛋白 A-I（apolipoproteinA-I，ApoA-I）是高密度脂蛋白（HDL）的主要结构蛋白，约占HDL总蛋白含量的70％。ApoaA-l的主要功能是抗动脉粥样硬化作用。在脂蛋白的代谢过程中，ApoA-l维持脂蛋白的结构和作为HDL受体的配体，还作为激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）的重要辅助因子，激活LCAT的活性，参与胆固醇的酯化。ApoA-l在胆固醇逆转运（reverse cholesterol transport，RCT）过程中起关键作用，促进组织细胞内胆固醇的清除，避免胆固醇在外周组织中沉积［16-19］。同时，研究发现了载脂蛋白 A I与机体非特异性免疫功能相关的新功能：抗内毒素（endotxin）、调节急性相反应（acute phase response，APR）中的中性粒细胞功能以及抗病毒［20-22］。

研究结果显示，肾阴虚证的标志蛋白质还有结合蛋白，如硒结合蛋白和维生素结合蛋白。

硒结合蛋白（Selenium binding protein l，SBP-1）主要是和硒结合，而执行调节人体免疫、抗肿瘤、抗氧化等许多重要的生理功能［23］。维生素 D结合蛋白（vitamin D binding protein，DBP）是一种可以增强中性粒细胞趋化活性、活化巨噬细胞的血清蛋白，并参与炎症过程［24、25］。维生素D结合蛋白（vilamin D-bjnding prolein））主要合成于肝脏，是属于白蛋白超家族中的一种结合蛋白［26］，其除了作为维生素 D在体内的蛋白结合物和载体，它还具有肌动蛋白清除功能、参与组织感染及损伤的应答机制，加强补体C5a介导的趋化活性等。

综上所述，本实验以方证相应学说为依据，应用蛋白质组学研究技术，找到并鉴定了1组肾阴虚证标志蛋白质，证明用此方法探寻肾虚证的标志蛋白质是可行的。本文根据这些蛋白质的功能，初步探讨了肾阴虚证的发生机理，至于这些标志蛋白质与肾阴虚证发生机制之间更深的关系，还有待进一步研究。

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