多色荧光STR新位点在诊断染色体数目中的应用研究

严晓玲 邹刚 段涛＊

（1.复旦大学，上海 200032；2.上海市第一妇婴保健院，上海 200040）

人类的遗传图谱绘制需要应用多态性标志。首先出现的多态性标志是20世纪80年代中期最早应用的限制性酶切片段长度多态性（RFLP）。此类标记数量较少，多态性信息含量也较低。80年代后发展了短串联重复序列（Short Tandem Repeat，STR），又称微卫星（microsatellite，MS），其染色体分布和信息含量明显优于RFLP。近年又有第三代多态性标志SNP被大量发现，成为研究基因组多样性和识别、定义疾病相关基因的一种手段。

STR具有高度多态性、杂合度和多态信息量，主要源于核心序列重复次数个体间的差异，这种差异在基因传递过程中一般遵循孟德尔共显性遗传规律，均匀地分布于人类基因组。本研究在50例无关个体中检测13、18、21号三条染色体上18个str位点的多态性和杂合度，并在5例21-三体综合征患者的外周血中进行检测，用以了解是否可在染色体数目异常的检测中被使用。

1 材料和方法

1.1 对象来源 从2008～2009年在本院就诊的患者，抽取50例正常人抗凝全血样本和5例21-三体综合征患者的外周血抗凝全血标本。

1.2 试剂和设备

1.2.1 试剂 QIAamp DNA Blood Mini Kit购自瑞士Qiagen公司；荧光素（FAM、HEX、TAMRA）和金牌Taq酶购自美国ABI公司；引物合成与荧光素标记由上海生工生物技术有限公司完成；PCR反应缓冲液、dNTP、Mg2+购自瑞士Qiagen公司。

1.2.2 设备 美国ABI公司2700型扩增仪、3130型遗传分析，德国EPPENDORF公司的微量移液器、高速离心机、ELGA公司纯水仪、德国Heraeus Biofuge Pico离心机。

1.2.3 引物设计和合成 在STR基因座的选择上，选择基因座首先符合Hardy-Weinberg平衡，多态信息含量大于0.5，杂合度在0.6以上的基因座［1］。串联重复单位为四或五核苷酸，确定的基因座见下表1。UCSC（http：／／genome.ucsc.edu／）上搜基因原序列。在引物设计过程中主要考虑以下影响因素：①引物长度在19～28bp之间；②各基因引物Tm值尽量一致；③PCR产物片段长度在400次／分以内。使用primer premier 5.0设计PCR引物。

表1 各STR位点及其引物信息

1.3 试验方法

1.3.1 PCR反应体系 反应体系为5μL：早先加入板中的10ng DNA模板（即2.5μL模板），0.25μM引物（正反引物各0.05μL），25units DNA聚合酶 （0.05μL），2mM MgCl2（0.3μL）及200μM dNTP（0.3μL）。热循环条件选用退火温度逐渐降低的程序（touchdown），如图1：

①94℃变性5分钟；

②94℃变性30秒；

③64℃退火30秒；

④72℃延伸60秒；

⑤ 返回②44个循环，退火温度依次下降0.5℃至57℃后维持；

⑥72℃延伸10分钟。

1.3.2 荧光素的选择 由于不同的荧光素在光谱上存在一定的干扰，荧光素的激发波长越接近，干扰会越强烈，不同的荧光素标记方式会产生不同的分子构象，从而影响分子的电泳迁移率和激光对荧光素的激发［2］。同时参考 Micel B等的文献报道，选择FAM、HEX、TAMRA进行试验。

1.3.3 毛细管电泳和测序 使用ABI3130基因测序仪，使用3130数据收集软件的样品列表，对样本设置不同名字和编码，确定内标，按颜色信息和解释将数据纳入表格中，建立荧光标记，用36cm毛细管运行模式处理样本，关键参数是聚合物和毛细管列阵的设置。经Gene Mapper ID 3.2软件分析处理。

其具体步骤为：

① 加入6.85μL GS500LIZ内标，与250μL Hi-Di甲酰胺混匀后，并取出15μL加入相应的96孔板中；

② 加入3μL待测PCR产物，混匀，密封96孔板；

③将96孔板置于PCR仪上94℃保持3分钟，降温到4℃保持30秒；

④1 000转离心10秒后放入测序仪中。

1.4 统计学分析 用SPSS12.0软件使用直接计算法，计算每个等位基因出现的频数与频率以及每个微卫星位点各杂合子峰面积比值的平均值和其标准差。

峰面积的计算公式根据色谱峰面积A的测量方法：

峰面积A=1.065h×w1／2（h为荧光峰的高度，w为峰宽）

杂合度的计算公式［3］：

H=N［1-∑pi2］／（N-1）（pi为第i个等位基因的频率，N为样本数）

PIC［4］的计算公式：

PIC=1-∑Pi2-∑∑2Pi2Pj2

i=1 i=1j=i+1

Pi、Pj分别为第i、j个等位基因的频率。

图1 热循环条件选用退火温度逐渐降低的程序（touchdown）

2 结果

2.1 50例正常无关二倍体中，根据染色体的不同，STR位点的杂合度和多态信息含量（见表2）。21号染色体选取11个STR位点（D21S11L、D21S1409、 D21S1809、 D21S2052、 D21S1994、D21S1446、 D21S1435、 D21S11D21S1442、D21S1809、D21S1432），其中D21S11的杂合度和多态信息含量最高，遗传多态性较佳。D21S1809遗传多态性较差。13号染色体选取3个STR位点（D13S800、D13S886、D13S796），其中D13S886遗传多态性较好、D13S800遗传多态性较差。18号染色体 选 取 4 个 STR 位 点 （D18S877、D18S851、D18S847、D18S847），其中D18S819遗传多态性较好、D18S851遗传多态性较差。

2.2 50例无关人群的外周血经过染色体核型分析证实为正常二倍体，通过对13、18、21染色体STR位点的检测，二倍体检出率为100%。

2.3 5例21-三体综合征患者的外周血抗凝血标本，检出率为100%。5例样本都呈现双峰面积比例1：2或2：1或1：1：1。图2为1例21-三体综合征患者的STR位点扩增产物图：

3 讨论

表2 STR位点的杂合度和多态信息含量

基因组扫描是目前定位疾病基因最常用的方法，在进行基因组扫描时，由于所选择的多态位点间距较大，为获得足够信息采用多态信息量高，分型容易的多态位点是连锁分析成功的关键，而STR的高度多态性和高频性的特点，使STR成为目前应用最广的人类遗传标志。STR绝大多数位于非编码区，不转录、不编码蛋白质和RNA，不受选择压力的影响，其2条带的扩增产量相等，不存在优先扩增和漏带现象。杂合度（heterozygosity）是指随机选择的某个个体在某一标记位点上同时具有2个不同的等位基因的可能性。PIC（polymorphism information content）是多态信息含量，是衡量DNA位点信息度（即利用该位点去对兴趣基因或者另一位点进行连锁分析时可以获得的信息量，从而判断该位点与其他基因或位点之间的连锁关系）的一个参数。PIC主要源于核心序列重复次数个体间的差异，这种差异在基因传递过程中一般遵循孟德尔共显性遗传规律，均匀地分布于人类基因组［5］。

STR遗传多态性可用杂合度和多态信息量等指标来衡量，多态信息量大于0.5，表明遗传标记可提供高度的遗传信息［6］。多态位点的基因频率、杂合度、多态信息含量等参数因样本来源、群体不同而有差异，本研究分析的18个位点均选自在白种人群中多态性较好的多态位点［7］。通过对50例正常无关亚洲人群外周血来检测STR的实际杂合度、多态信息量的检测，新位点的多态遗传信息含量为0.62～0.87，均＞0.5，表明本实验所选取的微卫星标记基本上可提供高度的遗传信息。结果显示实际的杂合度与文献和基因库中所记载的杂合度相似，但实际检测值较低可能与样本量较小有关。另外我们的预计值多来自西方文献报道，可能与我们汉族人群特别是上海地区人群存在一定差异。

在实际操作中会出现同一座位的等位基因会由于优先扩增而导致等位基因脱失（ADO），即在PCR反应起始时，一个正常的二倍体细胞的2个等位基因中的一个会被优先扩增，并随着反应地进行被优先扩增的产物也被用作模板过渡表达［8］，所以在结果中显示的等位基因的峰面积比值并不是完全的1：1，比值范围在0.9～1.28之间，与文献报道［9］的正常杂合二倍体每一检测位点双峰面积比值一般在0.8到1.4的范围内相符合。

高雅等曾以中国30个不同民族的9个常染色体STR基因座的群体遗传研究数据资料为对象，发现在一定范围之内，样本量的大小与所观测到的不同基因座等位基因检出数量之间存在正相关关系。当超过一定范围时，样本量的继续增加不再明显影响等位基因的检出数量。多态性低的基因座需要的样本量较小，50个样本量即可以检测出常见等位基因。

在使用单管多重QF-PCR体系中，我们使用新位点对5例21-三体综合征患者外周血进行检测，没用假阳性和假阴性，通过11个位点的结合检测，检出率高达100%。杜鹃［10］等曾采用5个位点检测21-三体，证实使用4个以上位点结合检出21-三体才可达100%。因此，上述新位点可被用于21-三体的诊断。

［1］ 高雅，李生斌.STR遗传多态性研究样本量对等位基因检出数量的影响［J］.遗传，2008，30（3）：313-320.

［2］ 李莉，陈光辉，李成涛，等.多色荧光STR检测试剂盒的研制与验证［J］.法医学杂志，2006，22（2）：111-115.

［3］ Hearne CM，Gho S，Todd JA.Microsatellites for linkage analysis of genetic traits［J］.Trends Genet，1992，8（8）：288-294.

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［5］ Weber JL，May PE.Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymorphism chain reaction［J］.Am J Hum Genet 1989，44（3）：388-396.

［6］ 陈艳炯，陈峰，辛娜，等.中国甘肃裕固族X-STR遗传多态性及其应用研究［J］.遗传，2008，30（9）：1143-1152.

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［8］ Adinofi M，Pertl B，Sherlock J，et al.Rapid detection fo aneuploidies by microsatellites quantitative fluorescent polymerase chain reaction［J］.Prenat Diag，1997，17（13）：1299-1311.

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［10］ 杜鹃，许娟娟，郑晨光等.STR新位点产前诊断21、13、18三体综合征［J］.中国优生与遗传杂志，2010，18（6）31-34