超声检测卵巢内膜样囊肿间质血流预测卵巢组织损伤的研究

刘颖蕾，刘曼华，邱君君，陈丽平，张忠新，刘宏斌

研究表明，卵巢血流变化能较深入地反映卵巢功能活动和病理现象［1］。卵巢内膜样囊肿 (ovarian endometriosis cyst，OEC)病理过程中，由于其生物学行为具有侵蚀性，可破坏卵巢间质致纤维化改变、微血管损伤，目前缺乏对此种病理改变的全面研究及其与超声血流变化关系的深入探讨。本文就此进行研究，术前采用经阴道彩色多普勒超声 (transvaginal color Doppler sonography，TV－CDS)检测OEC卵巢间质血流变化，术后通过免疫组化检测卵巢间质组织标本中转化生长因子－β1(transforming growth factor－β1，TGF－β1)、血小板反应蛋白－1(thrombospondin－1，TSP－1)及微血管密度 (microvessel density，MVD)的表达，探讨OEC间质血流对卵巢组织损伤的预测价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 研究组:选择2008年10月—2010年4月在我院手术治疗的 OEC患者60例，年龄25～40岁，平均(33.5±3.3)岁;B超测得所有囊肿长径2.5～6 cm，单侧44例，双侧16例，共计患病卵巢76个。对照组:选择同期在我院手术治疗的卵巢良性肿瘤患者30例 (成熟畸胎瘤10例，浆液性囊腺瘤10例，黏液性囊腺瘤10例)，年龄23～40岁，平均 (33.3±3.1)岁。本研究中因年龄＞40岁者正常卵巢血流显示率低［2］，均予以剔除，各组年龄分布间比较差异无统计学意义 (P＞0.05)，均知情同意，有性生活史。所有患者入院前3个月无激素类药物治疗史，无其他内分泌及全身性疾病史，无妇科手术史，术后均经病理证实。

1.2 研究方法

1.2.1 超声检查 应用Philips iU－22超声诊断仪，经阴道探头，频率10～15 MHz。受检者于围排卵期行超声检查，选取卵巢间质中较明显的动脉进行观测，紧邻卵泡或接近卵巢表面的动脉不作为观测目标。超声检查由同一位妇科B超医师进行。监测项目: (1)卵巢间质动脉血流显像，血流分级按Alder半定量标准［3］:0级为无血流显示，Ⅰ级呈星点状血流显示，Ⅱ级呈棒状或条状血流显示，Ⅲ级血流信号呈网状。(2)卵巢间质动脉血流阻力指数 (resistance index，RI)。

1.2.2 病理检查 收集术前有血流显示的卵巢间质组织蜡块切片。采用免疫组化SP法染色，鼠抗人TGF－β1单克隆抗体(克隆号:Sc－146)、鼠抗人TSP－1单克隆抗体 (克隆号:A6.1)购自美国New Markers公司。鼠抗人CD34单克隆抗体(克隆号:QBEnd/10)购自北京中衫金桥生物技术有限公司。操作步骤严格按照试剂盒说明进行。以PBS代替一抗做阴性对照。

结果判定:采取双盲法阅片，由两名不知临床资料的病理医师判定。(1)TGF－β1、TSP－1染色后主要定位于卵巢间质细胞胞浆，呈棕褐色。阳性结果的判定以着色程度及阳性细胞百分率综合判断:①着色强度:无棕黄色为0分，淡棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。②阳性细胞百分率:阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。将①和②积分相乘，0～4分为阴性或弱阳性 (－)，5～8分为阳性 (+)，9～12分为强阳性 (++)。(2)MVD测定:通过CD34标记内皮细胞以显示血管，CD34阳性染色为棕褐色，主要定位于血管内皮细胞胞浆。先在低倍镜 (100倍)下观察CD34表达较强的区域即“热点”区，继而高倍镜 (×400)下读取3个视野并将图像放大输入计算机以计数微血管数目。肌层太厚及管腔面积大于8个红细胞直径的血管均不计数。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件，根据资料性质分别采用独立样本t检验、χ2检验、Fisher确切概率法、秩和检验及Spearman等级相关，以P＜0.05为差异有统计学意义。

本文要点

卵巢内膜样囊肿 (ovarian endometriosis cyst，OEC)的生物学行为具有侵蚀性，可破坏卵巢间质致纤维化改变、微血管损伤，但目前尚缺乏对此种病理改变的全面研究及其与超声血流变化关系的深入探讨。本研究术前应用经阴道彩色多普勒超声检测60例OEC患者及30例卵巢良性肿瘤患者的卵巢间质血流信号及阻力指数(RI)，术后采集有血流显示的囊肿或肿瘤周边间质进行免疫组化染色，检测转化生长因子－β1(TGF－β1)、血小板反应蛋白－1(TSP－1)及微血管密度 (MVD)。结果显示，卵巢间质血流变化与TGF－β1、TSP－1和MVD表达的改变从不同角度反映了OEC的病理状态;超声检测卵巢间质血流可前瞻性地预测OEC对卵巢组织的损伤。

2 结果

2.1 术前TV－CDS检测卵巢间质血流 研究组60例OEC患者76个患侧卵巢血流不丰富，以Ⅰ级为主，占52.63%(40/76，见图1)，0级占32.89% (25/76)，血流呈高阻型，RI值为 (0.73±0.05)，与对照组比较差异有统计学意义 (P＜0.05，见表1)。

表1 两组卵巢间质动脉血流显像及RI值的测定Table1 Color Doppler flow grade and RI values of ovarian interstitial arteries in OEC and control group

2.2 术后免疫组化结果及其与术前超声血流RI值的关系

2.2.1 MVD计数及其与RI值的关系 研究组OEC卵巢间质中MVD为 (5.87±1.44)个/400倍视野，显著低于对照组(12.07±1.53)个/400倍视野，差异有统计学意义 (t=17.28，P＜0.01)。MVD与RI值呈负相关 (rs=－0.91，P＜0.01)。

2.2.2 TGF－β1表达及其与MVD、RI值的关系 TGF－β1在研究组OEC卵巢间质中的阳性表达率为70.59%(见图2)，在对照组良性肿瘤的阳性表达率为24.00%，两组比较差异有统计学意义 (χ2=17.23，P＜0.01)。TGF－β1表达与 MVD呈负相关 (rs=－0.70，P＜0.01)，与 RI呈正相关 (rs=0.77，P＜0.01)，表现为随TGF－β1表达增高，MVD下降，RI值增高，具体见表2。

表2 TGF－β1表达与MVD、RI值的关系Table2 Relationships between MVD，RI values and TGF－β1 expression

2.2.3 TSP－1表达及其与TGF－β1、MVD、RI的关系 TSP－1在研究组OEC卵巢间质中的阳性表达率为66.67%(见图3)，在对照组良性肿瘤的阳性表达率为16.00%，两组比较差异有统计学意义 (χ2=14.73，P＜0.01)。TSP－1表达与MVD呈负相关 (rs=－0.76，P＜0.01)，与TGF－β1、RI均呈正相关 (rs=0.90、0.81，P＜0.01)，表现为随TSP－1表达增高，MVD下降，TGF－β1表达与RI值增高，见表3。

表3 TSP－1表达与TGF－β1、MVD和RI值的关系Table3 Relationships between TGF－β1 expression rate，MVD，RI values and TSP－1 expression

图1 OEC卵巢间质内Ⅰ级血流Figure1 Star－shaped signals(grade I flow)within the ovarian interstitium of an OEC patient

图2 TGF－β1在OEC组中的表达 (免疫组化SP×100)Figure2 Positive expression of TGF－β1 in the OEC group

图3 TSP－1在OEC组中的表达 (免疫组化SP×100)Figure3 Positive expression of TSP－1 in the OEC group

3 讨论

3.1 超声间质血流评价OEC对卵巢间质组织的损伤 TVCDS是近年兴起的一种非损伤性评价盆腔器官血流灌注状态的超声检查方法，它的应用为我们更清楚地了解组织器官的生理功能变化和病理改变提供了一个无创的视窗。在围排卵期，TV－CDS检测到正常功能卵巢间质血流丰富，多呈网状［4］;卵巢良性肿瘤周围间质血流较丰富，多呈条状。由此可见，不同的卵巢间质血流可提示卵巢不同的病理生理状态。OEC卵巢间质血流不丰富、不易显示、频谱呈高阻型，RI值升高，本研究认为这种变化显示OEC病理过程中，因其生物学行为具有侵蚀性，囊肿周围组织结构及血管分布遭到破坏。

3.2 TGF－β1、TSP－1及MVD评价OEC对卵巢组织的损伤TGF－β1被大多数学者认为是纤维化形成与发展的启动枢纽［5］，高表达于肺［6］、肝［7］、肾［8］纤维化组织中，在 OEC 卵巢间质中TGF－β1表达增高，显示OEC卵巢间质纤维化。有研究认为在组织器官纤维化发生、发展过程中，基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)与金属蛋白酶组织抑制剂 (tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMPs)比例失调，抑制了细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)降解，加速了组织纤维化形成［9－11］。刘曼华等［12］曾报道，MMPs－TIMPs平衡的破坏在OEC疾病浸润、种植这一生物学行为中意义特殊。由此推断，在OEC浸润卵巢间质过程中，各种内、外源性因素刺激卵巢间质，破坏MMPs－TIMPs平衡，导致卵巢ECM过度积聚，间质组织发生纤维化改变。

TSP－1是TGF－β1的主要激活物［13］。OEC卵巢间质中TSP－1高表达与TGF－β1表达增强相一致，提示这两种细胞因子之间可能存在某种正反馈机制，即:在损伤因子的作用下，两种细胞因子之中任何一种的异常表达都将启动另一种的表达与活化，同时也会相互刺激而进行性增高，导致卵巢间质纤维化的发生、发展及加重。与近年来组织器官纤维化研究中提出的TSP－1、TGF－β1互为彼此激活物，促进纤维化发生发展［14－15］的观点相一致。

MVD是检测微血管生成的金标准，CD34单克隆抗体是血管内皮细胞的最可靠标记。OEC卵巢间质内CD34标记的MVD降低，提示OEC组织学上虽为良性，却有类似恶性侵袭的特殊生物学行为，但又不同于恶性肿瘤的间质血管增生、血管网密集［16］，而表现为随病情进展不断浸润、侵袭、破坏卵巢间质血管网。TGF－β1、TSP－1与MVD呈负相关，提示TSP－1、TGF－β1相关的卵巢间质纤维化与微血管损伤有关，微血管损伤可能通过组织缺血、缺氧及营养障碍，刺激细胞释放细胞因子，参与组织纤维化，导致卵巢组织损伤。

3.3 超声间质血流RI值与TGF－β1、TSP－1及MVD的关系 OEC卵巢间质血流RI与MVD呈负相关，提示这两项指标可从不同角度反映卵巢间质血管网的改变，两者相一致。RI又分别与TGF－β1、TSP－1呈正相关，考虑器官外周血管阻力的变化主要在于小动脉及微动脉的收缩程度，OEC卵巢间质中TGF－β1、TSP－1表达上调，使得卵巢间质纤维组织增生，血管壁顺应性降低，血管收缩受限，超声表现为血流阻力增高、灌注减少。

总之，本研究结果显示:超声血流指标与病理指标具有一致性，我们认为超声检测OEC卵巢间质血流变化可反映活体内卵巢间质纤维化及微血管损伤，可实时动态地评价OEC的病理状态，为进一步了解OEC的卵巢组织改变提供了一种非创伤性方法。

1 Joanie Mayer Hope，Kara Long，Marek Kudla，et al.Three－dimensional power Doppler angiography of cyclic ovarian blood flow［J］.J Ultrasound Med，2009，28(8):1043－1052.

2 Delgado－Rosas F，Gaytán M，Morales C，et al.Superficial ovarian cortex vascularization is inversely related to the follicle reserve in normal cycling ovaries and is increased in polycystic ovary syndrome［J］.Hum.Reprod，2009，24(5):1142－1151.

3 Alder DD，Carson PL，Rubin JM，et al.Doppler ultrasound flow imaging in the study of breast canner:Preliminary findings［J］.Ultrasound Med Biol，1990，16(6):553－559.

4 段丽，周慧丽，向红.卵巢早衰患者经阴道彩色多普勒超声检查的声像图特征［J］.中国全科医学，2010，13(6):2051.

5 Verrecchia F，Mauviel A.Transforming growth factor－beta and fibrosis［J］.World J Gastroenterol，2007，13(22):3056－3062.

6 Salazar KD，Lankford SM，Brody AR.Mesenchymal stem cells produce Wnt isoforms and TGF－β1 that mediate proliferation and procollagen expression by lung fibroblasts［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297(5):1002－1011.

7 尚军洁，李孝生.肝组织CTGF、TGF－β1的表达与肝纤维化关系的实验研究［J］.中国误诊学杂志，2010，10(13):3032.

8 Tian L，Li C，Qi J，et al.Diabetes－induced upregulation of urotensin II and its receptor plays an important role in TGF－β1－mediated renal fibrosis and dysfunction［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，295(5):1234－1242.

9 Kassiri Z，Oudit GY，Kandalam V，et al.Loss of TIMP3 enhances interstitial nephritis and fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20(6):1223－1235.

10 Catania JM，Chen G，Parrish AR.Role of matrix metalloproteinases in renal pathophysiologies［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，292(3):905－911.

11 Kwak HJ，Park MJ，Cho H，et al.Transforming growth factor－beta1 induces tissue inhibitor of metalloproteinase－1 expression via activation of extracellular signal－regulated kinase and Sp1 in human fibrosarcoma cells［J］.Mol Cancer Res，2006，4(3):209－220.

12 刘曼华，程英，陶潜.子宫内膜异位症与卵巢癌患者IL－6、IL－8变化及 MMP－9、TIMP－3的表达［J］.中国妇幼保健，2009，28(24):4019－4020.

13 Daniel C，Schaub K，Amann K，et al.Thrombospondin－1 Is an endogenous activator of TGF－β in experimental diabetic dephropathy in vivo［J］.Diabetes，2007，56(12):2982－2989.

14 Verrecchia F，Mauviela.Transforming growth factor－beta and fibrosis［J］.World J Gastroenterol，2007，13(22):3056－3062.

15 Christoph Daniel，Kathrin Schaub，Kerstin Amann，et al.Thrombospondin－1 is an endogenous activator of TGF－β in experimental diabetic nephropathy in vivo［J］.Diabetes，2007，56(12):2982－2989.

16 Tempe A，Singh S，Wadhwa L，et al.Conventional and color Doppler sonography in preoperative assessment of ovarian tumors［J］.Int J Gynaecol Obstet，2006，92(1):64－68.